[发明专利]一种利用红松催芽种子萌发芽体诱导不定芽的方法

权利要求书

1.一种利用红松催芽种子萌发芽体诱导不定芽的方法，其特征在于按照如下步骤进行操作：

（1）外植体的取材与消毒处理：取前一年收获的经混沙低温窑藏催芽处理的成熟红松种子，首先将红松抽出的芽体从种壳中取出，去掉胚乳后，洗衣粉水洗涤，流水下冲洗干净，去除种壳后采用质量百分含量为10%次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗5次，体积百分含量为70%酒精浸泡1mim，无菌水冲洗5次，再置于质量百分含量为0.1%的升汞溶液中消毒10min后，无菌水冲洗5次，即得到经过预处理的催芽红松种子外植体；

（2）不定芽的诱导：将步骤（1）消毒处理获得的外植体于超净工作台中切去胚根部位，按照形态学方向竖直放置于DCR培养基中进行不定芽的诱导培养；其中， DCR培养基中含2mg/L KT、0.5mg/L TDZ、500mg/L酸水解酪蛋白、500mg/L L-谷氨酰胺、质量百分含量为3%的蔗糖和质量百分含量为0.7%的琼脂，DCR培养基pH值5.7~5.8；

诱导培养条件：温度23±2℃、湿度60%~70%、光照时间14h/d、光照强度：2000-3000lux，培养时间为30d；

（3）不定芽的伸长生长：将步骤（2）诱导培养30d后获得的不定芽转接于DCR培养基中进行不定芽的伸长与增壮培养60d，并在培养至30d，更换一次新鲜的DCR培养基；

其中，DCR培养基含浓度为0.1mg/L的NAA、浓度为0.2~0.5mg/L的6-BA、浓度为500mg/L酸水解酪蛋白、500mg/L L-谷氨酰胺、1g/L活性炭，3%的蔗糖和0.7%的琼脂，DCR培养基pH值5.7~5.8；诱导培养条件：温度23±2℃、湿度60%~70%、光照时间14h/d、光照强度：2000-3000lux，培养时间为60d，其中30d更换一次新鲜的培养基；

（4）不定芽的生根诱导：将步骤（3）伸长与增壮培养的不定芽丛分离切割成单芽后置于1/2DCR培养基中进行生根驯化，即完成所述的；其中，1/2DCR培养基含0.5mg/L NAA、500mg/L酸水解酪蛋白、1g/L活性炭、 2%蔗糖和0.7%琼脂，pH值5.7~5.8。

2.根据权利要求1所述的一种利用红松催芽种子萌发芽体诱导不定芽的方法，其特征在于步骤（1）中红松成熟种子为前一年10月采收经低温沙藏催芽处理的成熟红松种子。

3.根据权利要求1所述的一种利用红松催芽种子萌发芽体诱导不定芽的方法，其特征在于步骤（1）中外植体的取材与消毒处理方法为：取前一年收获的经低温层级沙藏催芽处理的成熟红松种子，以胚根部伸出外种皮0.5-1cm为外植体材料，首先将红松抽出的芽体从种壳中取出，去掉胚乳后，洗衣粉水洗涤，流水下冲洗干净，质量百分含量为10%次氯酸钠浸泡20min，无菌水冲洗5次，体积百分含量为70%酒精1mim，无菌水冲洗5次，0.1%的升汞浸泡15min后，无菌水冲洗5次，即完成消毒处理。

4.根据权利要求1所述的一种利用红松催芽种子萌发芽体诱导不定芽的方法，其特征在于步骤（3）中将步骤（2）诱导培养30d后获得的不定芽置于DCR培养基中进行不定芽的伸长与增壮培养60d，并在培养至30d，更换一次新鲜的DCR培养基；步骤（3）中DCR培养基含0.1mg/L NAA、0.2mg/L 6-BA、1g/L活性炭、500mg/L酸水解酪蛋白、500mg/L L-谷氨酰胺、3%蔗糖和0.7%琼脂。

5.根据权利要求1所述的一种利用红松催芽种子萌发芽体诱导不定芽的方法，其中步骤(4)中生根驯化条件为：温度23±2℃、湿度60%~70%、光照时间14h/d、光照强度2000-3000lux。

6.根据权利要求1所述的一种利用红松催芽种子萌发芽体诱导不定芽的方法，其特征在于步骤四中不定芽丛的高度为2~3cm。