[发明专利]一种真核可溶表达家蚕微粒子虫极管糖蛋白的载体及方法

说明书

本发明涉及一种真核可溶表达家蚕微粒子虫极管糖蛋白的载体及方法，具体方法如下：构建含家蚕微粒子虫NbPTP1基因的重组载体，然后转染草地贪夜蛾sf9细胞进行表达，所述含家蚕微粒子虫NbPTP1基因的重组载体由IE2启动子调控表达；该方法成功可溶表达了家蚕微粒子虫极管糖蛋白，并且具有糖基化修饰，为进一步了解家蚕微粒子虫极管蛋白功能，阐明家蚕微粒子虫侵染机制提供理论基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种真核可溶表达家蚕微粒子虫极管糖蛋白的载体，还涉及真核可溶表达家蚕微粒子虫极管糖蛋白的方法。

背景技术

家蚕微粒子虫是微孢子虫属的典型种，其快速的水平传播和经卵垂直传播所引发的家蚕微粒子病给我国乃至世界养蚕业造成巨大危害。微孢子虫具有一个特殊的侵染结构——极管。极管主要由PTP1、PTP2和PTP3三种蛋白质组成。研究发现极管上含量最丰富蛋白PTP1是一个O-甘露糖基化蛋白，推测其蛋白被糖基化修饰后可有效抑制极管在宿主体内被降解，同时有益于PTP1与宿主细胞膜上的甘露糖受体之间相互作用，提高微孢子虫对宿主细胞的粘附，从而提高微孢子虫的侵染力。

家蚕微粒子虫极管蛋白NbPTP1仅溶于DTT、β-巯基乙醇等还原剂，且提取纯化具有糖基化修饰特征的极管蛋白极其不易。利用大肠杆菌原核表达系统异源表达的家蚕微粒子虫极管蛋白，不具有天然极管蛋白糖基化修饰特征而无法后续研究其糖基化修饰的功能。因此，急需一种能够表达糖基化修饰的天然极管蛋白表达的方法，为深入认识家蚕微粒子虫极管蛋白的特征与功能，阐明微孢子虫侵染机制提供更多的候选蛋白和研究线索，针对家蚕微粒子病的药物设计和防治方法提供重要的基础资料。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种真核可溶表达家蚕微粒子虫极管糖蛋白的载体；本发明的目的之二在于提供一种真核可溶表达家蚕微粒子虫极管糖蛋白的方法，本发明采用带有IE2启动子和带有Metallothionein启动子的两种重组载体分别在草地贪夜蛾sf9细胞和果蝇S2细胞中异源表达具有糖基化修饰的极管蛋白，比较发现两种昆虫细胞内均能表达NbPTP1蛋白，但仅有IE2启动子能将NbPTP1蛋白可溶性的异源分泌表达，后续通过亲和层析纯化到可溶的具有糖基化修饰的PTP1蛋白。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种真核可溶表达家蚕微粒子虫极管糖蛋白的载体，其特征在于：所述载体为家蚕微粒子虫NbPTP1基因连入重组质粒pSLI/V5-His的BamHI和XhoI酶切位点而得；所述重组质粒pSLI/V5-His是以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物，pIZ/V5-His载体为模板扩增获得插入片段OpIE2-MCS，再将插入片段OpIE2-MCS和中间载体pSLfa1180fa用AscI酶切后连接而得。

优选的，所述家蚕微粒子虫NbPTP1基因是以家蚕微粒子虫基因组DNA为模板，SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所述序列为引物扩增而得。

2、一种真核可溶表达家蚕微粒子虫极管糖蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：构建含家蚕微粒子虫NbPTP1基因的重组载体，然后转染草地贪夜蛾sf9细胞进行表达，所述含家蚕微粒子虫NbPTP1基因的重组载体由IE2启动子调控表达。

优选的，所述含家蚕微粒子虫NbPTP1基因的重组载体为家蚕微粒子虫NbPTP1基因连入重组质粒pSLI/V5-His的BamHI和XhoI酶切位点而得；所述重组质粒pSLI/V5-His由以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物，pIZ/V5-His载体为模板扩增获得插入片段OpIE2-MCS，再将插入片段OpIE2-MCS和中间载体pSLfa1180fa用AscI酶切后连接而得。

优选的，所述家蚕微粒子虫NbPTP1基因是以家蚕微粒子虫基因组DNA为模板，SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所述序列为引物扩增而得。