[发明专利]一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法

说明书

一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，属于生物技术领域。涉及多种蛭弧菌的富集法培养、宿主菌培养及其生物制剂的生产方法。其特征在于利用富集培养法培养的养殖水体中自然形成的蛭弧菌体系为生物制剂的蛭弧菌菌种来源，以养殖水体中的致病性弧菌经纯化、培养、离心、灭活后做为生产蛭弧菌制剂的宿主菌来源，生产一种含有多种蛭弧菌的生物制剂。这种方法生产的蛭弧菌制剂，由于含有多种蛭弧菌，具有活性高、作用迅速、对水体中的病原菌裂解普广等特性。

技术领域

本发明属于微生物除菌技术领域，具体涉及一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法。

背景技术

目前消除养殖水体中致病菌的方法主要以各种消毒剂和抗生素对水体进行消毒净化处理，这种方法能够迅速杀灭水体中的致病菌，但也杀灭了水体中的有益微生物，破坏了水体的微生态系统。长久的使用消毒剂及抗生素，导致致病菌的耐药性逐年增强，使用消毒剂和抗生素最终不能有效的控制致病菌。

近年来，利用有益微生物控制水产养殖中的病原微生物越来越受到各方关注，尤其是噬菌蛭弧菌制剂，它具有有效的裂解养殖水体中的副溶血弧菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌等致病性微生物，而且不使病原菌产生耐药性，对人和动物无害等优点，备受人们关注。

目前市场上的蛭弧菌制剂是以经过筛选纯化后的单一的、或人工复配的多株纯化后的蛭弧菌来生产，其工艺较为繁复，批次生产周期长、成本大。譬如专利申请号为201610513338.6的技术专利，提供了一种嗜菌蛭弧菌的生产方法，名称为“一种嗜菌蛭弧菌的生产方法”、专利申请号为93111749.6的技术专利，提供了一种嗜菌蛭弧菌的生产方法，名称为“生物制菌王及其生产方法”、专利号为00129401.6的技术专利，专利名称为“嗜菌蛭弧菌生物制剂及其生产方法”，提供了一种无宿主菌生产噬菌蛭弧菌的方法。上述生产蛭弧菌制剂所用蛭弧菌都是经过纯化后获得的单一的蛭弧菌菌株做为菌种，而养殖水体中通常同时具有多种致病菌，单一蛭弧菌菌株对多种致病菌的裂解能力是有限的，故存在应用效果不明显等问题。本发明克服了上述缺点，以本技术制备的蛭弧菌制剂应用于养殖水体，对于多数致病性微生物具有较强的裂解效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种以养殖水体中富集培养采集的多种蛭弧菌用于生产蛭弧菌制剂的方法。

本发明的具体方案如下：一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：宿主菌的分离：以TCBS选择性培养基培养分离并纯化养殖水体水样中的弧菌，并做为制备噬菌蛭弧菌制剂的宿主菌菌种；

步骤二：宿主菌浓悬液的制备：将步骤一纯化后的弧菌在液体培养基中培养至弧菌生长的稳定期后，得到发酵液；发酵液经离心分离去掉发酵液培养基，将余下弧菌菌体的菌泥以等体积的灭菌海水稀释，做水浴热灭活处理，获得灭活宿主菌浓悬液；

步骤三：噬菌蛭弧菌的富集培养：将过滤除菌后的养殖水体水样加入步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液，摇床培养至液体由浑浊转为清澈，即为噬菌蛭弧菌富集培养液；

步骤四：噬菌蛭弧菌母液的制备：取步骤三制备的蛭弧菌富集培养液与步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液，制备双层平板，培养至出现噬菌斑并融合后，加入灭菌海水浸泡，即为由多种蛭弧菌混合的蛭弧菌母液。

步骤五：噬菌蛭弧菌制剂的制备：将步骤四的蛭弧菌母液与灭活宿主菌悬浮液进一步扩大培养，得到蛭弧菌母液扩大液；按比例将灭活宿主菌浓悬液、蛭弧菌母液扩大液加入过滤除菌海水中，即为噬菌蛭弧菌制剂。

进一步的，所述的一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其具体工艺流程如下：