[发明专利]一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法

权利要求书

1.一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：宿主菌的分离：以TCBS选择性培养基培养、分离并纯化养殖水体水样中的弧菌，并做为制备噬菌蛭弧菌制剂的宿主菌菌种；

步骤二：宿主菌浓悬液的制备：将步骤一纯化后的弧菌在液体培养基中培养至弧菌生长的稳定期后，得到发酵液；发酵液经离心分离去掉发酵液培养基，将余下弧菌菌体的菌泥以等体积的灭菌海水稀释，做水浴热灭活处理，获得灭活宿主菌浓悬液；

步骤三：噬菌蛭弧菌的富集培养：将过滤除菌后的养殖水体水样加入步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液，摇床培养至液体由浑浊转为清澈，即为噬菌蛭弧菌富集培养液；

步骤四：噬菌蛭弧菌母液的制备：取步骤三制备的蛭弧菌富集培养液与步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液，制备双层平板，培养至出现噬菌斑并融合后，加入灭菌海水浸泡，即为由多种蛭弧菌混合的蛭弧菌母液；

步骤五：噬菌蛭弧菌制剂的制备：将步骤四的蛭弧菌母液与灭活宿主菌浓悬液进一步扩大培养，得到蛭弧菌母液扩大液；按比例将灭活宿主菌浓悬液、蛭弧菌母液扩大液加入过滤除菌海水中，即为噬菌蛭弧菌制剂。

2.根据权利要求1所述的一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其具体工艺流程如下：

步骤一：宿主菌的分离：取养殖水体水样接种于TCBS弧菌选择性培养基，涂布均匀后置于5℃的恒温培养箱中倒扣培养24小时，从出现的弧菌菌落中，挑取蓝绿色单菌落的弧菌在TCBS平板上连续划线接种培养3～5次，直到出现显微镜观察菌体形态一致、菌落形态一致的菌落，接种于NB斜面试管培养24小时，即为本制剂的弧菌的宿主菌菌种；

步骤二：宿主菌浓悬液制备：将步骤一纯化后的宿主菌菌种以NB培养基试管扩大培养，取经24小时培养后的试管菌种，无菌操作注入稀释液，洗下试管斜面上的菌苔，摇匀后再接种于经121℃灭菌的弧菌增 菌液体培养基，置于120r/min、35℃摇床培养24～36小时，培养至菌弧生长的菌数稳定期后，即为得到需要的弧菌发酵液；将弧菌发酵液置于6000r/min离心15分钟，去掉发酵液培养基部分，将余下的弧菌菌泥以等体积的灭菌海水稀释，即为宿主菌浓菌悬液，进行水浴热灭活处理，即为灭活宿主菌浓悬液；

步骤三：噬菌蛭弧菌的富集培养：取养殖水体水样，经0.22um孔径的细菌滤器过滤除菌后，接种步骤二中制备的灭活宿主菌浓悬液，置于120r/min、25℃～30℃的摇床培养5～7天，培养液由浑浊转为清澈，即为噬菌蛭弧菌富集培养液；

步骤四：噬菌蛭弧菌母液的制备：制备双层平板：将琼脂加热溶于自然海水中，琼脂浓度为5g/L，以0.1摩尔/L的氢氧化钠调节PH值为7.2，装入三角瓶中即为上层培养基；将琼脂加热溶于自然海水，琼脂浓度为15g/L，以0.1摩尔/L的氢氧化钠调节PH值为7.2，倒入平板中，每只平板倒入15mL，即为下层平板；将上述上层培养基和下层平板置于121℃灭菌30分钟后，下层平板冷却待用，将装有上层培养基的三角瓶置于45℃水浴锅中待用；将步骤三噬菌蛭弧菌富集培养液、步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液按比例加入水浴45℃的上层培养基，混合均匀后倒入冷却的下层平板中，使上层培养基均匀分布在下层平板内的下层培养基的上方，将平板移入28℃恒温箱培养5～7天，培养24小时后开始出现大小不一的噬菌斑，5～7天噬菌斑融合后，在平板中加入灭菌海水浸泡4小时，将浸泡液移入无菌试管中，即为由多种蛭弧菌混合的蛭弧菌母液；

步骤五：噬菌蛭弧菌制剂的制备：蛭弧菌母液扩大液的制备：取灭菌海水、步骤四制备的蛭弧菌母液、步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液按比例混合均匀，置于150r/min、28℃的摇床培养5～7天，液体清澈后即为蛭弧菌母液扩大液；取过滤除菌的海水、以上制备的蛭弧菌母液扩大液、步骤二制备的灭活宿主菌浓悬液按比例混合均匀，置于25℃～28℃静置培养5～7天，即为噬菌蛭弧菌制剂。

3.根据权利要求1所述的一种富集培养法制备噬菌蛭弧菌制剂的方法，其特征在于，步骤一所述的宿主菌菌种为养殖水体水样中分离并纯化的副溶血弧菌。