[发明专利]强化yugT表达的地衣芽孢杆菌DW2-yugT的应用

说明书

本发明提供一种强化yugT表达的地衣芽孢杆菌DW2‑yugT的应用，本发明通过基因工程的方法在地衣芽孢杆菌DW2的基因组内插入葡萄糖苷酶YugT的基因—yugT，达到了强化葡萄糖苷酶YugT表达的目的。相对于地衣芽胞杆菌DW2来说，本发明所构建得到的菌株在杆菌肽发酵过程中发酵液中杆菌肽的产量提高了18%以上。

技术领域

本发明属于基因工程菌改造技术领域，尤其是一种强化葡萄糖苷酶YugT表达的地衣芽胞杆菌菌株及制备方法和应用。

背景技术

地衣芽胞杆菌是公认的具有生物安全性（GRAS）的重要工业微生物菌株，其广泛存在于自然界中，其属于革兰氏阳性菌。目前，由于地衣芽胞杆菌具有遗传背景清晰、培养条件简单、工业应用价值高等特点，因此近年来被广泛研究。目前，地衣芽胞杆菌被主要用来生产聚γ-谷氨酸、杆菌肽、乙偶姻、2,3-丁二醇、地衣素及各种酶制剂等生物化工产品。与此同时，其也可以作为良好的异源蛋白表达宿主菌，从而应用于异源蛋白的表达。

杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，其氨基酸包括鸟氨酸（Orn），D-苯丙氨酸（D-Phe），异亮组氨酸（His）, D-天冬氨酸（D-Asp）, 天冬酰胺（Asn）、 赖氨酸（Lys）, D-谷氨酸（D-Glu），半胱氨酸（Cys），亮氨酸（Leu），异亮氨酸（Ile） 和缬氨酸（Val）11种氨基酸。杆菌肽可以抑制或杀灭某些致病菌，强烈抑制革兰氏阴性菌的生长，并与其它抗生素（如青霉素、庆大霉素等）具有协同增强效应；并且，其几乎不会在动物的肠道内被吸收，而且排泄迅速，没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。

地衣芽胞杆菌中存在着众多与菌株代谢产物的合成息息相关的基因，而，杆菌肽的产量与何种基因相关仍然是个未知数，通过何种基因改造的方式得到高产杆菌肽的工程菌也有待进一步的研究。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种强化葡萄糖苷酶YugT表达的地衣芽胞杆菌菌株（Bacillus licheniformis）的制备方法，此构建方法通过在地衣芽胞杆菌的基因组内插入葡萄糖苷酶YugT的基因—yugT，达到了强化葡萄糖苷酶YugT表达的目的。

强化YugT表达的地衣芽胞杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：

（1）以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yugT基因片段，再在yugT基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的yugT表达元件；

（2）同时，以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yugT基因的上游同源臂和yugT基因的下游同源臂；

（3）通过重叠延伸PCR将步骤（2）得到的yugT基因的上游同源臂、步骤（1）得到的yugT表达元件和步骤（2）得到的yugT基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：yugT基因的上游同源臂-yugT表达元件-yugT基因的下游同源臂；

（4）采用BamHI和 XbaI限制性内切酶对步骤（3）得到的目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；

（5）准备质粒 T2(2)-ori，并采用BamHI和XbaI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；