[发明专利]强化yugT表达的地衣芽孢杆菌DW2-yugT的应用

权利要求书

1.强化yugT表达的地衣芽孢杆菌（ Bacillus licheniformis） DW2-yugT的应用，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌DW2-yugT应用于杆菌肽生产中，所述地衣芽孢杆菌DW2-yugT的构建方法，包括以下步骤：

（1）以地衣芽孢 杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yugT基因片段，再在yugT基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的yugT表达元件；

（2）同时，以地衣芽孢 杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yugT基因的上游同源臂和yugT基因的下游同源臂；

（3）通过重叠延伸PCR将步骤（2）得到的yugT基因的上游同源臂、步骤（1）得到的yugT表达元件和步骤（2）得到的yugT基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：yugT基因的上游同源臂-yugT表达元件-yugT基因的下游同源臂；

（4）采用BamHI和XbaI限制性内切酶对步骤（3）得到的目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；

（5）准备质粒 T2(2)-ori，并采用BamHI和XbaI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

（6）将步骤（4）得到的酶切基因片段和步骤（5）得到的线性质粒片段经 DNA连接酶进行连接，得到整合质粒T2(2)-yugT；

（7）将步骤（6）得到的整合质粒T2(2)-yugT转入地衣芽孢 杆菌DW2中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，并抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到yugT基因的上游同源臂或yugT基因的下游同源臂与地衣芽孢 杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

（8）挑选yugT基因的上游同源臂与地衣芽孢 杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与yugT基因的下游同源臂与地衣芽孢 杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，再经PCR法筛选得到整合了yugT基因的地衣芽孢 杆菌DW2-yugT；

其中，所述的地衣芽孢 杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；

所述地衣芽孢 杆菌DW2的基因组DNA序列中的yugT基因如 SEQ ID NO.1 所示。

2.根据权利要求1所述的强化yugT表达的地衣芽孢杆菌DW2-yugT的应用，其特征在于，该应用步骤包括： A种子发酵，B生产发酵。

3.根据权利要求2所述的强化yugT表达的地衣芽孢杆菌DW2-yugT的应用，其特征在于，所述种子发酵的培养基配方为：6-10g/L蛋白胨，2-6g/L酵母浸出粉，6-10g/L氯化钠，pH7.0 ~ 7.2。

4.根据权利要求2所述的强化yugT表达的地衣芽孢杆菌DW2-yugT的应用，其特征在于，所述生产发酵的培养基配方为：60-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8g/LCaCO₃和0.5-2g/L (NH₄)₂SO₄。