[发明专利]一种靶向EGFR二聚化界面的单链抗体及其应用

说明书

本发明公开了一种靶向EGFR二聚化界面的单链抗体及其应用。所述融合蛋白含有从5’到3’依次连接的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的重链可变区蛋白、连接肽、氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的轻链可变区蛋白的氨基酸序列。本发明构建并优化了靶向EGFR二聚化界面的单链抗体的基因及毕赤酵母工程菌，通过发酵及分离纯化获得了该单链抗体，即通过基因工程技术成功高效地制备了靶向EGFR二聚化界面的单链抗体，该抗体，相对分子质量较小，穿透性好，在对实体瘤治疗中，抑瘤效果大大提高，能有效抑制EGFR异常表达肿瘤细胞的增殖生长，这将为后续EGFR新型抑制剂的开发打下基础，有巨大的应用价值。

技术领域

本发明涉及EGFR异常表达的肿瘤的治疗技术领域，更具体地，涉及一种靶向EGFR二聚化界面的单链抗体及其应用。

背景技术

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，简写为EGFR)是酪氨酸激酶Ⅰ型受体家族的一个成员，该家族的其他成员包括HER2、HER3及HE R4。EGFR受体分为三部分，即胞外配体结合区、跨膜固定区和胞内酪氨酸激酶区。特异性的配体和EGFR受体结合后，引起受体由无活性的单体状态转变为激活的二聚化状态，EGFR与自身或家族其它成员之间形成二聚体，进而激活胞内的酪氨酸激酶，其胞内段的酪氨酸残基被自身磷酸化或交叉磷酸化，招募含有SH2结构域的信号转导蛋白或信号蛋白，与残基紧密结合，形成多蛋白的复合物进行信号转导，引起下游包括PI3K-Akt、MAPK-Erk等信号通路的激活，调控细胞的生长和增殖。EGFR正常表达与细胞的基本生理活动密切相关，但当EGFR异常表达时，常会促进肿瘤细胞的生长、迁移、浸润和抗凋亡。EGFR已成为肿瘤治疗的重要靶标。到目前为止，针对EGFR已经开发出单克隆抗体(MAbs)和小分子酪氨酸酶抑制剂(TKIs)两大类药物。单克隆抗体目前在我国已上市的有西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(Panitumumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)等；小分子抑制剂有吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)和拉帕非尼(Lapat inib)等。这两类药物的临床有效率仅有10％～20％，分析原因，一是配体存在着较强的竞争结合，二是所靶向的区域有很高的突变性。因此需要开发新的靶向药物来提高临床疗效。

目前，HER家族受体二聚化的构成形式主要有两种：同源二聚化和异源二聚化。如图1所示：当无配体与受体结合时，EGFR受体以单体形式存在，无生物活性；当特异性配体与受体结合时，其构象发生改变，暴露二聚化臂，以与另一分子的EGFR或HER家族其它受体形成二聚体，从而引发受体胞内区的酪氨酸磷酸化，激活信号转导的第二信使，引发下游一系列生化反应。因此，“二聚化”是EGFR家族受体共有的且必需的活化步骤，在二聚化界面选择高度保守的区域作为抗体的靶向位点，就有可能通过抗体的空间障碍作用有效阻止受体的同源或异源二聚化，从而抑制EGFR信号的活化。

在前期的研究中，发明人获得一种靶向EGFR二聚化界面的单克隆抗体5G9，体外和体内实验证明，它可以特异性地结合肿瘤细胞表面的EGFR，抑制肿瘤的生长，作为一种新型的EGFR抑制剂，显示了良好的应用前景。

传统的单克隆抗体由2条完全相同的重链和2条完全相同的轻链构成，相对分子质量较大，穿透性差，在对实体瘤治疗中，抑瘤效果大大地受到影响。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供新一代抗EGFR抗体——一种靶向EGFR二聚化界面的单链抗体。利用基因工程技术，构建靶向EGFR二聚化界面的单链抗体，实现此单链抗体在酵母菌中的表达，并比较、分析单链抗体的功能，对其结合活性、抗肿瘤活性进行研究，以其能为EGFR异常表达的肿瘤的治疗提供新的治疗方法。

本发明的第一个目的是提供一种靶向EGFR二聚化界面的单链抗体的重链可变区蛋白。

本发明的第二个目的是提供一种靶向EGFR二聚化界面的单链抗体的重链可变区基因。