[发明专利]一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法

权利要求书

1.一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法，其特征在于1）生产一级种子液制备：从菌种库里面取出猪支原体肺炎活疫苗（168株）菌种，在无菌操作间，无菌打开，用pH值为7.4-7.6的KM₂液体培养基原体积溶解冻干菌种，并按照质量比1:10继代于KM₂液体培养基中，放入37℃恒温培养箱48-72小时，待培养物颜色略微变黄，pH值为6.2-6.8时，收获菌液，纯粹检验合格作为一级种子液；2）重复步骤1），分别扩大培养制备二级种子液和三级种子液；3）将生产及检验好的三级种子液按照质量比1:10接种于30L种子罐内的KM₂液体培养基中，培养基体积为20L，培养基初始pH值调为7.6，37℃培养，转速设定为100r/min，培养24h、32h、40h、48h、56h各取样1次，pH值为6.2-6.8时，到达要求后收获，经纯粹检验及无菌检验合格后，准备再次放大；4）将30L种子罐内的培养物按照质量比5%-10%接种到300L培养罐内的KM₂液体培养基中，培养基体积为200L，培养基初始pH值为7.6，37℃静置培养24 h内pH值、溶氧、葡萄糖水平无明显变化，24h后按照搅拌速度100 -150r/min，工作罐压维持在0.06-0.08MPa，通气量维持在100L/min、200L/min、300L/min或一次性通气以维持在饱和浓度的30%-60%，补充NaOH碱液以维持pH值的稳定在7.2，并在补充葡萄糖维持1000mg/L，培养24h后，每间隔8h，取样进行CCU测定，绘制培养物的生长曲线；5）测定培养物在发酵罐培养64-72h时滴度达到10⁹CCU/mL，收获培养物；上述冻干保护剂含有明胶和蔗糖，其余为蒸馏水，其中明胶含量为3wt.%或6wt.%，蔗糖含量为25 wt.%，上述抗原与冻干保护剂在37℃温室下混合，其抗原与冻干保护剂的体积比为5:5、6:4、7:3、8:2或9:1，抗原与冻干保护剂分装在7mL或10mL西林瓶中，装量体积分别为2mL、3mL或4mL，上述冻干技术为先进行-40℃预冻3h~4h，一期升华-40℃～-15℃，18h ~28h，干燥-15℃～28℃，14h ~17h；或者，-40℃预冻4h，一期升华-40℃～-15℃，14h ~18h，干燥-15℃～28℃，6h ~14h；程序控温设定：-50℃30min；-8℃ 15h；13℃ 1h10min；28℃ 6h50min，最后启动压塞，进行冻干疫苗的压塞、出箱。