[发明专利]一种表达卵形疟原虫AMA1蛋白的病毒疫苗的制备方法

说明书

本发明公开了一种表达卵形疟原虫AMA1蛋白的病毒疫苗的制备方法，属于病毒学和基因工程技术领域。本发明将表达卵形疟原虫顶端膜蛋白‑1的基因插入到水疱性口炎病毒VSV基因组载体中，构建重组病毒载体骨架质粒XN2‑AMA1，用含T7RNA聚合酶的痘病毒感染乳仓鼠肾细胞(BHK‑21)后，将质粒XN2‑AMA1及结构蛋白质粒pN、pP、pL共转染BHK‑21细胞，在细胞内实现重组病毒的拯救，包装出表达AMA1的类病毒颗粒，形成重组病毒rVSV‑AMA1即为本发明疫苗。本发明疫苗操作简单、产生滴度高、免疫周期短、可诱导强烈的体液及细胞免疫应答，有可应用于临床使用的巨大潜能。

技术领域

本发明涉及病毒学和基因工程技术领域，尤其是涉及一种表达卵形疟原虫AMA1蛋白的重组水泡性口炎病毒疫苗的制备方法。

背景技术

疟疾是一种古老的人类疾病，至今为止仍是全球范围内最重要的传染性疾病之一，在全世界90多个国家中流行，超过3到5亿人感染疟疾，每年都有150～270万人感染，其中儿童是感染致死的主要人群。疟疾是由疟原虫通过蚊虫叮咬感染传播的疾病，寄生于人体的疟原虫共有4种，即恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫。其中恶性疟原虫是引起感染最为严重的一种，卵形疟原虫与其他疟原虫相比引起的感染症状轻微，因此受到了相对较少的关注度。目前对疟原虫的治疗和研究主要集中在恶性疟和间日疟，对于卵形疟研究较少，但在近几年的病例报告中显示感染卵形疟原虫可能引起严重的并发症例如急性呼吸窘迫综合征和急性肾衰竭等严重疾病，这提示寻找一种预防和治疗其感染的有效手段十分必要。

长久以来，疫苗一直被公认为预防病原体感染的最直接有效的手段，理想的疫苗应当具备以下条件：(1)用于人、畜的疫苗必须安全，无副作用；(2)稳定性好，能够诱导较强的体液及细胞免疫应答，产生较好及持久的保护性免疫；(3)免疫方法简单，且免疫次数少；(4)生产成本低，节省原料、可大量制备。

目前针对疟原虫的疫苗主要分为两大类：一类是基因工程亚单位疫苗，该疫苗是将保护性抗原基因表以其产物蛋白质或多肽制备的疫苗，例如针恶性疟原虫环子孢子蛋白CSP疫苗 RTS，S及顶端膜蛋白-1(AMA1)和网织红细胞结合蛋白RH5的亚单位疫苗，都表现出了一定的保护性效果。这些疫苗具有安全性高，纯度高，稳定性好得优点，但是其免疫效果较差，一般需要合适的佐剂辅助；另一类是载体疫苗，是将抗原通过微生物载体递送到体内引起免疫反应。以黑猩猩复制缺陷性腺病毒载体ChAd63和痘病毒安卡拉MVA载体制备的疟原虫疫苗能够有效的诱导特异性免疫应答，产生特异性保护效果，展现出了较好的应用前景。

以水疱性口炎病毒VSV为载体的疫苗同样属于病毒载体疫苗，水疱性口炎病毒VSV为弹状病毒科的单股负链RNA病毒，VSV基因组为不分节段的单股负链RNA(ssRNA)病毒，长约11kb，从3′端→5′端依次排列着N、NS、M、G、L 5个不重叠的基因，分别编码核(N) 蛋白、磷酸(P)蛋白、基质(M)蛋白、糖(G)蛋白、及RNA聚合酶(L)蛋白等5种不同的主要蛋白。通过反向遗传操作系统将插入抗原的病毒基因组及结构蛋白N、P、L整合为类病毒颗粒，形成重组的病毒载体疫苗，该疫苗特点是操作简单，产生滴度高，免疫周期短，单次免疫即可产生有效保护，可诱导较强的特异性体液及细胞免疫应答。与亚单位疫苗相比具有更强的免疫原性，与腺病毒载体相比单次免疫即可诱导较强免疫反应，是一种应用前景更好的疫苗。

疫苗免疫效果的好坏不仅取决于免疫方式，更重要的因素在于抗原。作为候选疫苗的抗原应为疟原虫感染的关键分子，阻断该抗原可有效抑制疟原虫感染。疟疾的危害主要是虫体反复入侵红细胞进行增殖破坏所致，裂殖子是疟原虫入侵红细胞的为一阶段，阻断裂殖子入侵可有效控制疟疾发作。顶端膜蛋白-1(AMA1)疟原虫裂殖子表面的一种膜蛋白，在裂殖子在定向和启动裂殖子顶端形成紧密结合的过程发挥关键作用，是疟原虫入侵红细胞时期的重要蛋白，以AMA1为抗原的疫苗免疫动物可以有效抵御疟原虫的感染。

发明内容