[发明专利]一种表达卵形疟原虫AMA1蛋白的病毒疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种制备卵形疟原虫疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）构建pXN2-AMA1重组质粒：将编码Genbank登录号SCP04661.1卵形疟原虫顶端膜蛋白-1AMA1的基因，通过Xho1和Nhe1酶切位点插入到水疱性口炎病毒基因组G和L限制性酶切位点之间，构建重组VSV骨架质粒pXN2-AMA1；

（2）培养乳仓鼠肾细胞BHK-21；

（3）待乳仓鼠肾细胞生长至80%~90%汇合率，用含T7RNA聚合酶的痘病毒感染BHK-21细胞；

（4）通过反向遗传操作将重组的骨架质粒pXN2-AMA1及表达水疱性口炎病毒结构蛋白N、P、L的质粒pBS-N、pBS-P、pBS-L转染BHK-21细胞；

（5）转染后，当细胞有50%以上病变产生，则收集细胞上清液，并过滤除去混合在上清中的痘病毒；

（6）将步骤（5）得到过滤后的上清液再次感染新鲜的BHK-21细胞；

（7）在倒置荧光显微镜下观察细胞是否有病变产生，当细胞有大于50%病变即可收集上清，离心除去细胞碎片后，在-80℃保存，即得重组rVSV-AMA1疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种制备卵形疟原虫疫苗的方法，其特征在于，步骤（1）中所述构建的重组质粒经过去内毒素处理。

3.根据权利要求1或2所述的一种制备卵形疟原虫疫苗的方法，其特征在于，步骤（2）在10cm细胞培养皿中接种5×10⁶个乳仓鼠肾细胞，用含有10%FBS的DMEM培养基在37℃，5%CO₂细胞培养箱中培养。

4.根据权利要求 1或2所述的一种制备卵形疟原虫疫苗的方法，其特征在于，步骤（3）待细胞生长至80%~90%汇合率，将BHK-21细胞培养液弃掉，将痘病毒用DMEM无血清培养基稀释感染BHK-21细胞。

5.根据权利要求1或2所述的一种制备卵形疟原虫疫苗的方法，其特征在于，步骤（5）转染48h后观察BHK-21细胞病变情况，当细胞有50%以上病变产生，则收集细胞上清液，并用0.22μm滤膜过滤以除去混合在上清中的痘病毒。

6.根据权利要求1或2所述的一种制备卵形疟原虫疫苗的方法，其特征在于，步骤（6）将步骤（5）得到过滤后的上清液再次感染新鲜的BHK-21细胞，置于5%CO₂细胞培养箱中继续培养48h。

7.根据权利要求1~6任一所述的方法制备得到的疫苗。