[发明专利]一种特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的检测试剂及其制备方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种特异性检测(1‑3)‑β‑D‑葡聚糖的检测试剂及其制备方法。本发明分别得到了鲎G因子酶原α亚基、β亚基和凝血酶原基因的核苷酸优化序列，如SEQ ID NO：1～3所示；还得到了共同表达上述3种关键因子的核苷酸序列，如SEQ ID NO：4所示；并成功构建了单独表达或共同表达3种关键因子的真核表达载体，最后成功获得了类似天然鲎试剂的人工鲎试剂，可用于检测(1‑3)‑β‑D‑葡聚糖，而且灵敏度高，特异性强，可降低假阳性，制备工艺简单，无需提取纯化蛋白，生产成本低，同时大大减少对野生鲎资源的需求，具有广阔的市场应用前景。

技术领域

本发明属于生物检测和医疗技术领域，具体地，涉及一种特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的检测试剂及其制备方法。

背景技术

深部真菌感染发病率逐年上升，因缺少有效的早期诊断手段，其病死率居高不下。目前，检测真菌感染的方法有血培养、组织活检、PCR技术和免疫学方法。其中，血培养和组织活检因培养方法耗时长和检出阳性率低，不宜作早期诊断；PCR只能检测已知致病真菌感染，不适合早期诊断罕见的条件致病真菌感染；而免疫学方法要做多种真菌抗原筛查，易漏诊，且费时又不经济。

鲎的血细胞溶解物可被微量的细菌内毒素或微量的真菌细胞壁成分(1-3)-β-D-葡聚糖激活产生一系列的酶促反应最终形成凝胶，该反应的机理如图1所示。深部真菌感染的严重程度常与血浆(1-3)-beta-D-葡聚糖(即(1-3)-β-D-葡聚糖)的升高水平一致，而(1-3)-β-D-葡聚糖可特异性激活自鲎血细胞的G因子，此过程称为G试验。G试验在深部真菌感染的早期诊断中具有较高敏感性和特异性，所以临床检验已收录G试验作为真菌感染的早期诊断方法。

鲎试剂主要成分包括C因子、B因子、G因子、凝固酶原、凝固蛋白原(或显色基质)、二价阳离子和缓冲盐等。但是，因鲎凝血过程有两条不同的激活途径，一条是内毒素介导的C因子途径：C因子(FC)结合内毒素而被激活，然后激活B因子，活化的B因子将凝固酶原(Proclotting enzyme)转化为凝固酶(clotting enzyme)，凝固酶将凝固蛋白原转化为凝固蛋白，凝固蛋白相互交联脱水而形成凝胶；另一条是由1,3-β-D-葡聚糖介导的G因子(FG)途径，同样可以引起相似的凝集反应，产生假阳性结果，因此，自然来源的鲎试剂不能直接用于检测真菌感染。

目前，尽管有在鲎试剂中通过添加抗脂多糖物质来增加检测特异性的方法，但其并不能完全阻断内毒素对G试验的干扰，容易产生假阳性结果。另外，鲎试剂只能通过收集鲎血淋巴生产，制备鲎试剂严重依赖鲎资源，随着生物制品、医药如：注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器械(如一次性注射器，植入性生物材料)等生产单位迅速增长，真菌感染检测试剂的需求越来越大，使得海洋中鲎的数量逐渐减少。因此，开发不依靠使用鲎血淋巴的，用于诊断真菌感染的鲎血G因子变得越来越重要。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述现有技术的缺陷，提供一种特异性检测(1-3)-β-D-葡聚糖的检测试剂。该检测试剂可作为天然鲎试剂的替代品，排除了C因子旁路干扰，从而有效地避免了内毒素产生假阳性的可能性，灵敏度高、特异性强，并且解决了鲎数量有限、鲎试剂各批次不稳定性的缺点，可作为新型(1-3)-β-D-葡聚糖检测试剂，可通用于现有的各种采用(1-3)-β-D-葡聚糖检测诊断技术检测真菌感染的试剂盒。

本发明的第一个目的在于提供一种表达鲎G因子酶原α亚基和β亚基的重组基因。

本发明的第二个目的在于提供一种表达鲎凝血酶原的重组基因。

本发明的第三个目的在于提供一种共表达鲎G因子酶原α亚基、β亚基和凝血酶原的重组基因。

本发明的第四个目的在于提供一种含有上述任一所述的重组基因的真核表达载体。

本发明的第五个目的在于提供一种含有上述真核表达载体的宿主细胞。