[发明专利]一种表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法及应用

说明书

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术与基因工程改造技术领域，提供了一种表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法，包括如下步骤：目标序列选取，构建含嵌合抗原受体的pCDH载体，将乙酰肝素酶HPSE的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中，慢病毒的包装，表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备。本发明还提供了上述表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞在实体瘤免疫治疗方向上的应用。本发明的优点在于：提供了一种表达乙酰肝素酶HPSE的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用，其表达的HPSE可以提高免疫细胞在肿瘤微环境中的迁移能力，为实体瘤的治疗提供了新的思路和途径。

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术与基因工程改造技术领域，尤其涉及一种表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法及应用。

背景技术

过继细胞疗法(ACT)是抗癌的新型工具。用于表达嵌合抗原受体(CARs)的T细胞已经证实了显著的临床疗效，特别是一些血液系统恶性肿瘤(Maude SL，2014；Porter DL，2015；Garfall AL，2015)。CARS是由细胞外结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号转导/激活域组成的合成分子。胞外组分由来自抗体的轻链和重链区组成，以形成单链可变片段(scFv)，并用于以MHC独立的方式识别和结合特异性肿瘤相关抗原(TAAs)。通常来源于CD8或IgG4分子的铰链结构域将该胞外模块与细胞内的模块连接起来，最后一部分是由负责触发T细胞活化的CD3ζ片段形成的。第二代CARS和第三代CARS分别添加一个或两个共刺激结构域，通常是CD28和/或4-1BB。

通过scFv识别抗原，避免了HLA的限制，具有高特异性和有效的激活，CARs表达这些分子已经成为最有前途的癌症治疗方法之一。虽然嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法代表了血液恶性肿瘤(如B-ALL)的革命性治疗，然而，这种治疗还没有在实体瘤中实现成功(PuleMA，2008；Bawley VS，2012)。T细胞治疗实体肿瘤的三大障碍主要是(1)肿瘤相关抗原的识别；(2)过继转移的细胞向肿瘤部位的运输受限；(3)肿瘤微环境的免疫抑制作用。

当前，进行实体瘤靶向治疗常用的靶点主要包括EpCAM、HER2以及GPC3等。EpCAM属于单次跨膜I型糖蛋白，EpCAM基因位于人染色体2p21，基因长度14kbp，相对分子量40kDa，其分子结构由胞外结构域、单次跨膜结构域和胞内结构3部分构成，其主要编码一种肿瘤相关抗原，多数表达与正常上皮细胞和上皮源性恶性肿瘤细胞。EpCAM参与调节细胞间粘附、迁移、增殖及信号传导。EpCAM的过表达导致Wnt-β-连环蛋白信号通路这一经典的肿瘤信号通路的激活，通过Wnt级联反应激活原癌基因e-myc和cyclinA/E的表达，诱导细胞的增殖。多项研究证据表明，EpCAM在多种肿瘤组织中呈高水平表达，在肿瘤细胞的增殖中扮演着重要角色，因此EpCAM成为前列腺癌、肝癌等多种癌症免疫靶向治疗的重要靶点。人表皮生长因子受体2(HER2)是具有酪氨酸激酶活性的表皮生长因子受体家族的一个成员。受体的聚合作用会导致受体酪氨酸残基的磷酸化，并启动多种信号通路导致细胞增殖和肿瘤发生。作为预后和预测生物标志物，大约15–30％的乳腺癌和10–30％的胃/食管癌会发生HER2基因扩增或过表达。HER2的过度表达也可见于其他肿瘤如卵巢、子宫内膜、膀胱、肺、结肠和头颈部。HER2靶向治疗极大的改善了HER2阳性乳腺癌、胃/食管癌患者的预后。Glypican-3(GPC3)蛋白为硫酸肝素糖蛋白家族成员之一，CPC3相对分子质量约为66×103，它富含一段包括14个半胱氨酸残疾的独特序列，在N末端有一种分泌型信号蛋白，C端通过与糖基磷脂酰肌醇共价结合而锚定于细胞膜上，且硫酸乙酰肝素链插入点的位置均由C端最末50个氨基酸决定，是该链靠近细胞膜。CPC3在在调控细胞生长和分化方面起重要作用，与肝癌的发生、发展密切相关，有报道称，肝癌组织中GPC3阳性率达到74.5％。所以GPC3在肝癌组织中特异性高表达的特性，可作为肝癌治疗的新靶点。