[发明专利]敲减人IL-15的siRNA、CD19 CAR表达载体、CAR-T细胞及构建方法和应用有效
| 申请号： | 201810814375.X | 申请日： | 2018-07-23 |
| 公开（公告）号： | CN108949759B | 公开（公告）日： | 2021-06-01 |
| 发明（设计）人： | 徐华栋;刘振云;韩江萌;王维;程丰伟 | 申请（专利权）人： | 合肥一兮生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/867;C12N15/62;C12N5/10;A61P35/00 |
| 代理公司： | 合肥市浩智运专利代理事务所(普通合伙) 34124 | 代理人： | 丁瑞瑞 |
| 地址： | 230000 安徽省合肥市高新区*** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 减人 il 15 sirna cd19 car 表达 载体 细胞 构建 方法 应用 | ||
1.一种利用敲减人IL-15的siRNA的应用，其特征在于：所述siRNA在体外制备CD19CAR-T细胞中的应用；
所述siRNA为：
a.正义链序列如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，反义链序列如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。
2.一种敲减人IL-15的siRNA的重组慢病毒表达载体，其特征在于：所述表达载体为CD19 CAR的pCDH慢病毒载体；
所述siRNA为：
a.正义链序列如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，反义链序列如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。
3.一种敲减人IL-15的siRNA的重组慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：其构建方法包括：
（1）CD19 CAR的pCDH质粒载体的构建；
（2）将所述siRNA序列克隆进入CD19 CAR的pCDH质粒载体中，获得敲减IL-15重组pCDH慢病毒质粒载体；
（3）敲减人IL-15的重组pCDH慢病毒载体的包装；
所述siRNA为：
a.正义链序列如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，反义链序列如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的敲减人IL-15的siRNA的重组慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中CD19 CAR采用二代CAR的组成方式，所述CD19 CAR由识别CD19分子的scFv片段，CD8跨膜区，4-1BB片段，CD3ζ片段组成，所述CD19 CAR序列如SEQ ID NO.9所示。
5.根据权利要求3所述的敲减人IL-15的siRNA的重组慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中使用NotI与BamH1-F两种限制性内切酶进行酶切，将所述siRNA序列克隆进入CD19 CAR的pCDH载体中，随后转染DH5α大肠杆菌，进行载体扩增以及测序鉴定，获得敲减IL-15重组pCDH慢病毒质粒载体。
6.根据权利要求3所述的敲减人IL-15的siRNA的重组慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：所述步骤（3）中得到的敲减IL-15重组pCDH慢病毒质粒载体分别与质粒GAG、REV、VSV共同转染293T细胞，在293T细胞中进行基因转录表达后，包装成功敲减IL-15重组pCDH慢病毒载体会释放到细胞培养上清中，收集包含的敲减IL-15是siRNA重组pCDH慢病毒载体的上清液。
7. 一种敲减IL-15的CD19 CAR-T细胞，其特征在于：所述的CAR-T细胞是由所述siRNA修饰的T淋巴细胞；
所述siRNA为：
a.正义链序列如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，反义链序列如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的敲减IL-15的CD19 CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR-T细胞的制备方法包括以下步骤：（1）T细胞的培养；（2）通过所述敲减IL-15的siRNA重组慢病毒载体转染T细胞。
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