[发明专利]表达CD40抗体的慢病毒载体、CAR-T细胞的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种表达CD40抗体的慢病毒载体、CAR‑T细胞的构建方法及应用，涉及肿瘤免疫治疗技术领域，基于巨噬细胞会促进肿瘤恶化的问题而提出的。本发明包括一种携带CD40抗体的实体瘤特异性抗原靶点的CAR基因的慢病毒表达载体、表达CD40抗体的实体瘤特异性抗原靶点的CAR‑T细胞，本发明的有益效果在于：解决依赖TCR识别某种抗原的T细胞会大量增殖，并可能引起炎症等的不良反应，保证CAR‑T细胞能够特异性且专一地发挥肿瘤杀伤能力。

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种表达CD40抗体的慢病毒载体、CAR-T细胞的构建方法及应用。

背景技术

2017初，国家癌症中心发布了中国最新癌症数据，每一项数据都用客观的事实告诉我们：中国正在面临着一场抗癌战争。每天约1万人诊断癌症，每分钟约7人确诊患癌。癌症新发人数继续上升，从358万增加到368万，增幅3％；世界新发病例约1409万，中国新发癌症病例占世界的1/4。我国癌症的治疗面临着巨大的挑战，目前传统的疗法主要有手术、化疗、放疗和靶向疗法，在一些癌症的治疗方面有一定的作用，但对于很多癌症的治疗效果非常局限。癌症的免疫疗法(Cancer Immunotherapy)是继手术、化疗、放疗和靶向疗法之后出现的一种新型治疗方法，它是利用患者自身免疫系统的力量来抵抗癌症，所有的癌症的发生从逻辑上都需要突破免疫系统的监视，而免疫疗法主要通过增强机体免疫系统功能，来消灭肿瘤细胞。免疫治疗经历了多年的不断发展，近几年取得了越来越多令人鼓舞的研究成果，包括针对免疫监控点分子或靶向抗原的单抗，双特异性抗体，肿瘤疫苗等。而在众多免疫疗法中，最受瞩目且具前景的当属嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，它是免疫疗法与基因疗法相结合的创新疗法。

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)即CAR-T技术是通过将识别肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA，是指一些肿瘤细胞表面糖蛋白或糖脂成分，它们在正常细胞上有微量表达，但在肿瘤细胞表达明显增高)的scFv(单链抗体可变区片段)、跨膜区片段(CD8、CD28)、胞内信号分子(CD3ξ)，共刺激因子(CD28、4-1BB、OX40)在体外进行基因重组，生成重组载体，再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者T细胞表达嵌合抗原受体。转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，也即CAR-T细胞，这些嵌合抗原受体修饰后的T细胞具备特异杀伤患者体内肿瘤细胞的能力。T细胞对肿瘤细胞具有很强的杀伤作用，在肿瘤免疫应答中起主要作用。但是肿瘤细胞表面的MHC(主要组织相容性复合物)在免疫编辑的过程中会出现表达下降的情况，这样长期形成的免疫逃逸机制，能使肿瘤细胞成功躲避T细胞攻击，肿瘤快速增殖。此外，人体内肿瘤特异性的T细胞数量较少，并且由于大多数肿瘤细胞不断表达自体抗原，使得靶向这些抗原的T细胞通过免疫耐受机制被中和或移除，数量进一步减少。而CAR的修饰可使T细胞在获得靶向杀伤能力的同时获得更强的增殖及抗凋亡的能力，这种靶向杀伤的特异性来自于识别肿瘤相关抗原的单链抗体与其抗原的特异性结合，而不需要通过传统的抗原呈递免疫激活途径，从而克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，打破宿主的免疫耐受。所以，它是针对肿瘤治疗的一种优势明显的精准医疗的策略。

从全球大量开展的CAR-T临床实验来看，CAR-T技术在血液肿瘤、淋巴瘤的治疗上具有令人印象深刻的卓越疗效，而在实体瘤方面，有一些令人鼓舞的突破，但还面临着诸多难点问题需要攻克。