[发明专利]表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行Card3基因敲除

说明书

本发明提供了一种采用CRISPR‑cas系统针对表皮干细胞进行Card3基因编辑，特别是涉及一种构建Card3基因敲除的表皮干细胞细胞系的建立。其中构建并获得了二个特异的gRNA，能够显著提高表皮干细胞内CRISPR/Cas9针对Card3的基因编辑效率。本发明提供的表皮干细胞Card3敲除质粒具有较好的遗传稳定性以及较高的打靶效率。

技术领域

本发明提供一种采用CRISPR-cas系统针对表皮干细胞进行CARD3基因编辑，特别是涉及一种构建CARD3基因敲除的表皮干细胞细胞系的建立。

背景技术

表皮干细胞(Epidermal stem cells，EpiSCS)是具有自我增殖和多向分化潜能的干细胞，它的正常增殖和分化是维持皮肤及其附属器(汗腺毛发、皮脂腺)结构和功能完整性的基本要求。在生理条件下，表皮干细胞通过不对称分裂方式分化为一个干细胞和一个短暂扩充细胞(transit amplifying cellsTA细胞)，TA细胞再经过多次分裂后分化为有丝分裂后细胞(Post-mitotic cells)及终末分化细胞(terminally-differentiatedcells)，以补充表皮细胞不断更新的需要。研究表明表皮干细胞不仅能在体外长期传代培养，并保持其增殖分化潜能(Dunnwald et al，Exp Dermatol，2001，10：45-54.Papini etal.stem cells，2003，21：481-494)，而且，在一定环境条件下还表现出与胚胎干细胞相似的分化潜能[Liang et al，stem cells，2002：20：21-31]。因此，获得纯化的表皮干细胞不仅可为构建有生理功能的人工皮肤提供种子细胞，而且可用于基因治疗和转基因动物的生产。

人类多能干细胞(Humanpluripotent stem cells,hPSCs)和基因组编辑技术结合所建立的细胞模型，为疾病研究提供了一个独特的实验平台。利用这个平台体系，研究人员可以研究特定基因突变甚至染色体结构变异对人类多种细胞类型和组织器官功能的影响及其详细的分子机制，并可建立携带不同遗传突变的“个性化”疾病模型用于大规模药物筛选。该模型体系的建立得益于基因组编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins9,CRISPR/Cas9)技术的飞速发展。

Card3(Caspase activat1n and recruitment domain 3)也被称作RIP2，受体相互作用蛋白2(receptor_interacting protein 2)，属于RIP家族成员，在多种组织中均有分布，是一个丝/苏氨酸蛋白激酶，介于激酶域和CARD域之间的媒介领域，最初在1998年由3个独立的研究小组筛选RIP和CARD同源蛋白时发现的，Card3分布于胞质内，在组织表达广泛，其mRNA高表达于脾、外周血白细胞、胎盘、睾丸和心脏等组织中。Card3在固有免疫、适应性免疫和炎症反应中起重要作用，并参与多种疾病发生。许多研究发现当感染细菌及病毒时，Card3可介导NF-κΒ的激活并引起炎症反应，尤其在N0D/RIP2信号途径中，Card3作为其下游因子引起宿主适当的免疫反应。Card3的一个显著特征是其表达在转录水平以细胞特异的、时间依赖的方式被调控。Card3的表达增加反应于细胞特异的刺激，包括细菌的肽聚糖和脂多糖。

CN103877576A公开一种Caspase激活及募集结合域3(Card3)基因在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的功能和应用。本发明以Card3基因敲除小鼠和心脏特异性Card3转基因小鼠为对象，通过阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支造成心肌梗死模型进行研究，结果表明与WT小鼠对比，Card3基因敲除小鼠心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显被抑制，心功能明显好转；而Card3转基因小鼠与Card3基因敲除小鼠表型相反。表明Card3基因能够促进并加重冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生发展，Card3可作为药物靶标筛选治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物，Card3的抑制剂可用于制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物。