[发明专利]一种高酶活淀粉酶的表达方法

说明书

本发明公开了一种高酶活淀粉酶的表达方法，先敲除米曲霉中的AO090701000363基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。本发明通过同源重组将米曲霉中的AO090701000363基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AO090701000363敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶，试验结果证实：AO090701000363的缺失显著提高了米曲霉淀粉酶的活性，第3天，AO090701000363敲除菌株的淀粉酶活性是参照菌株的1.5倍左右，后续两天缺陷株的活性是参照菌株的2倍之多。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种高酶活淀粉酶的表达方法。

背景技术

淀粉酶是酶制剂中用途最广、消费量最大的一种。主要用于面包生产中的面团改良(降低面团粘度、加速发酵进程、增加糖含量、缓和面包老化)；婴幼儿食品中谷类原料的预处理；啤酒制造；工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生物制剂等多种领域。米曲霉被美国FDA及世界卫生组织列为食品级安全菌株(GRAS)，是工业上淀粉酶的重要来源。通过基因敲除手段选育出更高酶产量的米曲霉，有助于米曲霉在工业上更好的应用。

淀粉是自然界最丰富的原料之一，是人类食物的重要成分，淀粉很容易从植物中获得，价格低廉。淀粉利用的关键是通过淀粉酶降解为可发酵的葡萄糖等可发酵性糖。根据作用的方式可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物中。

米曲霉应用历史悠久，随着人类发展生活所需，获得高产淀粉酶的菌株，降低淀粉酶的生产成本成为淀粉酶工业化利用的必由之路，选育优良的菌株是酶制剂产业的核心问题。米曲霉相对于植物和哺乳动物具有较强的蛋白质分泌、合成能力以及快速生长，易培养等优点，与大肠杆菌和酵母相比也具有强大的翻译后修饰功能，被认为是生产淀粉酶最有应用前景的菌株之一。目前获得优良的高产量菌株，通常采用诱变和基因工程构建基因工程菌株等方法。诱变方法简单成本低，但是具有一定的随机性，因此基因工程技术手段是未来选育高产量菌株的一个有效方法，特别的米曲霉的全基因组的破译更促进了基因工程技术的应用。发展安全、通用、高效、规模化表达系统，是全面提高酶制剂产业技术水平的战略必争之地，对于酶制剂产业实现变革性突破具有十分重要的意义。

米曲霉中淀粉酶转录激活因子AmyR在淀粉或麦芽糖的诱导下会激活下游淀粉酶的表达，而CreA和CreB参与调控淀粉酶转录因子AmyR的表达。米曲霉淀粉酶生产的瓶颈在于：在米曲霉培养后期存在着反抑制调控，其会抑制米曲霉淀粉酶的生产，虽然这方面有研究通过删除单creA和双creA/creB基因片段，一定程度上提高了在高浓度培养后期的淀粉酶活性，但效果不是很明显。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种高酶活淀粉酶的表达方法，通过同源重组将米曲霉中的AO090701000363基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AO090701000363敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种高酶活淀粉酶的表达方法，先敲除米曲霉中的AO090701000363基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。

所述的高酶活淀粉酶的表达方法，通过同源重组将米曲霉中的AO090701000363基因用选择标记基因pyrG代替，从而实现AO090701000363敲除。

所述的高酶活淀粉酶的表达方法，具体步骤如下：

1)利用PrimeStar PCR聚合酶扩增并获得AO090701000363基因两侧片段和pyrG基因；

2)将AO090701000363基因两侧片段与pyrG基因融合；