[发明专利]一种安全高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术

说明书

本发明针对现有CRISPR/Cas9基因编辑技术脱靶效应的技术缺陷，对Cas9蛋白的DNA序列结合的位点进行了氨基酸位点定点突变，获得了脱靶效率低的Cas9蛋白，从而实现靶向性更好更高效的基因编辑功能。同时，本发明还提供了一种采用此基因编辑方法进行HEK293T细胞基因编辑的方法。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种安全高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术

背景技术

规律性重复短回文序列簇/CRISPR相关基因(Clustered regulatoryinterspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated genes,CRISPR/Cas)系统是细菌对噬菌体的长期抗争过程中进化产生的一种获得性免疫防御系统，普遍存在于细菌与古生菌中。

CRISPR是一类独特的DNA串联重复序列，CRISPR基因座由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔序列区(Spacer)组成。Cas基因一般位于CRISPR基因座附近。根据Cas基因核心元件序列的不同，CRISPR/Cas免疫系统被分为3种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系统需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而Ⅱ型CRISPR/Cas免疫系统只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链。Ⅱ型系统是目前被改造得最为成功的人工核酸酶，其CRISPR/Cas基因座结构包括5'端的tracrRNA(trans-activating crRNA)基因，tracrRNA主要与CRISPR转录产物(CRISPR-derived RNA，crRNA)形成crRNA：tracrRNA复合体，帮助Cas9蛋白识别并与crRNA：tracrRNA复合体结合，实现靶点特异性识别；中间是一系列Cas蛋白编码基因(包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2)，主要发挥核酸酶切割作用；3'端是CRISPR基因座。

目前，CRISPR/Cas9系统已作为一种基因组编辑技术被广泛地研究和利用，该技术利用人工设计的向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)介导外源表达的Cas9蛋白与基因组靶点特异性结合，以实现对基因组DNA的特异性切割，切割后的基因组DNA通过非同源末端连接或同源重组的方式进行修复，从而实现基因的敲除、敲入等。相比传统的基因打靶技术如锌指核酸酶(Zinc-fingernucleases，ZFN)和转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription activator-likeeffector nucleases，TALEN)，CRISPR/Cas系统技术具有技术流程简易、基因编辑效率高、特异性更强、应用范围更广的优势。

然而，作为基因编辑技术，脱靶效应是不可避免的一个缺点，影响了其临床转化应用的进程。因此，如何在提高CRISPR/Cas技术基因编辑效率的同时提高其靶向性，是该技术目前面临的一大难题。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明对pSpCas9载体进行了修饰，提高其靶向性。

本发明针对已发表文献中的Cas9蛋白的晶体结构(见图1)中DNA序列结合的位点进行氨基酸突变，获得了脱靶效率低的Cas9蛋白，其序列见序列表中序号1的Cas9蛋白序列，晶体形态见图1，其中突变位点有：848号氨基酸位点碱基序列为GCG，对应的氨基酸为丙氨酸；1003号氨基酸位点碱基序列为GCG，对应的氨基酸为丙氨酸；1060号氨基酸位点碱基序列为GCG，对应的氨基酸为丙氨酸。新得到的SpCas9我们命名为SpCas9-SZ。

相比现有的CRISPR-Cas9系统技术，本发明构建的CRISPR-Cas9系统具有以下优势：