[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿基因定点突变的方法

说明书

本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿基因定点突变的方法。本发明首次在异花授粉的同源四倍体植物紫花苜蓿中使用CRISPR/Cas9技术，并获得突变植株；首次使用MtU6启动子在紫花苜蓿中启动sgRNA转录，提高转录效率；与自然突变以及传统人工诱导突变相比，本发明以更高的突变效率精准地引入突变，能达到突变率52%，其中纯合突变率达12%。本发明直接在基因编码序列上进行突变，为在紫花苜蓿中进行基因编辑开辟了新的领域，为后续同时沉默多个基因、染色体大片段缺失、外源基因精准插入靶点、基因调控等奠定了技术基础。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种利用CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿基因定点突变的方法。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa.)是广泛种植的豆科牧草，富含优质膳食纤维、食用蛋白、多种维生素(包括维生素B、维生素C、维生素E等)、多种有益的矿物质以及皂苷、黄酮类、类胡萝卜素、酚醛酸等生物活性成分，蛋白含量高、适口性好，对于提升牲畜的饲料水平具有重要意义。除了作为饲草料作物，紫花苜蓿发达的根系在防治水土流失、环境治理方面发挥重要作用。此外，因为紫花苜蓿根部有大量的固氮微生物共生，紫花苜蓿在改善土壤肥力上也具有重要的意义。针对紫花苜蓿基因功能的研究有助于改善紫花苜蓿的性状，辅助培育具备更优性状的紫花苜蓿新品种。在紫花苜蓿中使用基因沉默技术抑制目的基因的表达是研究基因功能与培育新品种的一种非常有效的手段。

自然界中虽经常发生自发突变，但突变频率极低，大多数基因位点每代自发突变的突变率约为10^-5或10^-6，且只有发生上在配子中的突变才可以传到下一代。通过化学诱变、物理诱变以及DNA插入突变等诱变方法处理植物材料，可以在短时间内获得有利用价值的突变体。诱变因素引发的突变频率较高，比自发突变频率高几百倍，甚至上千倍，而且诱发突变的变异范围广泛，类型多样，有时能够诱发产生自然界稀有的或未曾有过的新突变。但是通过诱变方式引入的突变是随机的，很难针对某一位点得到纯合突变体，同样的，使用诱变方法产生的突变只有发生在配子中的突变才可以传到下一代。靶向基因沉默技术是研究特定基因功能的有效手段。目前，针对靶向基因沉默已经开发出RNAi(RNA干扰)，以及ZFN、TALLEN、CRISPR/Cas9等基因编辑技术。RNAi技术主要降解目的基因转录出来的mRNA序列，下调mRNA的翻译水平，从而实现抑制目的基因表达的作用。但是，通过RNAi技术降低目的基因表达时，目的基因的基因序列没有被突变，在一定程度上仍可能有目的基因表达。相反，使用ZFN、TALLEN、CRISPR/Cas9技术实现的基因沉默，在DNA水平上突变基因序列，使基因彻底丧失功能。与RNAi相比，这三种技术更加稳定、高效。在TALEN、ZFN、CRISPR/Cas9三种技术中，TALEN与ZFN需要针对每一个靶位点将识别不同碱基的氨基酸序列元件按靶点序列拼装起来，每一个靶位点都有自己独特的蛋白质序列，这就导致该过程耗时、耗力、成本高昂。与TALLEN以及ZFN不同的是，CRISPR/Cas9技术是通过sgRNA上的靶向序列识别靶位点，靶向序列与靶点之间通过碱基互补配对的方式互相识别，这种方式更加简便、廉价、操作方便。所以，自2013年CRISPR/Cas9技术被首次应用于基因编辑以来，得到快速、广泛的发展。CRISPR/Cas9系统是来自链球菌属的一种获得性免疫系统，可以抵御外源基因的入侵。它主要由CRISPR和特异的Cas9蛋白组成。CRISPR是一成簇的规律间隔的短回文重复序列，是一类新型的DNA重复序列，它由一系列短的高度保守的正向重复序列和长度相似的间隔序列间隔排列组成。Cas9蛋白是一种由1409个氨基酸组成的多结构域蛋白，含有两个核酸酶结构域RuvC-like和HNH。基于CRISPR/Cas9的基因组编辑体系包括2部分：sgRNA及酶Cas9。这种系统能够特异的识别毗邻PAM(NGG)基序的靶序列，并在其上游3nt处进行切割形成DSB(double strains break),随后机体通过自身的修复机制如同源重组(HR)、非同源末端连接(NHEJ)来修复损伤的DNA。NHEJ方式的修复过程能够产生Indel(包括缺失和插入)，进而导致DNA编码序列移码突变。