[发明专利]一种四环素诱导启动子及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种四环素诱导启动子及其制备方法和应用，所述启动子为将组成型启动子的间隔序列突变为四环素操纵基因；其中，所述间隔序列包括‑35区至‑10区之间的核酸序列、‑10区至转录起始位点之间的核酸序列或‑(55±3)bp至‑35区之间的核酸序列中的任意一种或至少两种的组合。本发明将组成型启动子的间隔序列突变为四环素操纵基因，并利用四环素操纵基因与四环素阻遏蛋白的特异性结合作用，使得组成型启动子受四环素诱导调控，实现了四环素对目的基因的表达调控；将包括四环素诱导启动子和目的基因的表达载体导入嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌，高效启动了目的基因的表达，实现了对嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌的改造。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种四环素诱导启动子及其制备方法和应用。

背景技术

嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌是一种高GC含量的革兰氏阴性菌和好氧性光合硫细菌，可以在pH为7-11、Na⁺为0-4M的环境中生长。它是一种化能自养型微生物，以二氧化碳为碳源，硫化钠或硫代硫酸钠等硫物质为电子供体，在氧化硫物质的过程中产生单质硫或硫酸盐。相比于其他生物脱硫微生物，嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌对高盐高碱环境具有耐受性，克服了传统脱硫微生物脱硫率低的缺陷，但是存在生长速度慢的缺点，增加氧气量可以加快嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌的生长速率，但会降低单质硫的回收率，造成硫酸盐大量积累，形成二次污染。对硫氧化菌进行基因工程改造可以提高固定二氧化碳的速率，增加单质硫的回收量，增强硫化物的脱除效果。

目前，基因工程的改造方法主要包括诱变和筛选，然而这些方法工作量大，效率较低。CN 105087625A公开了一种嗜盐嗜碱硫碱弧菌的遗传转化方法，包括如下步骤：1)将分离纯化后的菌株接种在硫碱弧菌合成培养基中培养，培养时间为12～18h，OD₆₀₀值在0.5～0.9之间时收集菌体；2)通过CaCl₂-NaCl溶液处理的方法，制备具有吸附外源DNA能力的感受态细胞；3)通过热激反应，将外源的带有抗性的质粒导入步骤2)的感受态细胞中；4)将导入质粒的感受态细胞进行孵育，涂布在抗性平板上，筛选具有抗性的转化菌株。然而这种筛选的方法效率较低，得到的优良菌株的比例较低。

随着嗜盐嗜碱硫氧化菌基因组测序工作的完成，硫氧化菌的代谢网络图谱不断完善，对硫氧化菌进行定向基因编辑改造成为可能。发明人在前期的实验研究中，利用接合转移的方式，将携带有异源基因的表达质粒转化入菌体，增强了硫碱弧菌的生长速率和脱硫速率。然而，启动异源基因表达的启动子仅限于组成型启动子(例如Pgpx)，尚未构建得到诱导型启动子调控基因转录。此外，嗜盐嗜碱硫氧化菌细胞膜上缺乏糖类分子转运蛋白，因此传统的乳糖、半乳糖或木糖等诱导型启动子不能应用于菌株中。

因此，提供一种诱导剂毒性小、可自由扩散进入细胞的实用的诱导型启动子，在生物技术领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种四环素诱导启动子及其制备方法和应用，所述四环素诱导启动子在嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌中作为严谨型诱导启动子，在转录水平高效调控基因表达，是搭建遗传改造平台不可或缺的元件。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种四环素诱导启动子，所述启动子为将组成型启动子的间隔序列突变为四环素操纵基因；

其中，所述间隔序列包括-35区至-10区之间的核酸序列、-10区至转录起始位点之间的核酸序列或-(55±3)bp至-35区之间的核酸序列中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，将组成型启动子的间隔序列突变为四环素操纵基因，使得组成型启动子受四环素诱导调控，实现了四环素对目的基因的表达调控。

优选地，所述组成型启动子包括谷氨酸过氧化物酶启动子。

本发明中，所述谷氨酸过氧化物酶启动子是嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌D301基因组中第847671-847457位的自身组成型启动子。