[发明专利]用于免疫检测的微球的制备方法

说明书

本发明涉及一种用于免疫检测的微球的制备方法，该方法包括1)使用缓冲液稀释所述微球和待标记物；2)得到所述微球与待标记物的混合溶液；3)加入交联剂进行孵育；4)加入封闭剂封闭；其中，所述微球为羧基微球；步骤1)中的缓冲液的pH为6.3～9.5。本发明还涉及由该方法制备得到的微球及含有该微球的试剂盒。

技术领域

本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种制备用于免疫检测的羧基微球的方法。

背景技术

免疫学检测方法主要有酶免疫测定法、免疫比浊法、胶体金免疫测定法、化学发光测定法、荧光免疫测定法、放射免疫测定等。其中，使用微球的免疫学方法制备的诊断试剂，由于能够为自动分析仪器所利用，因此近年来在临床检查等中被广泛使用。在将微球用于免疫检测诊断时，通常使用与测定对象结合的待标记物对微球进行标记。在样本中含有测定对象时，通过使其与微球所负载的待标记物结合，引起微球凝集。从而通过测定该凝集的程度，确定测定对象的有无或其含量。

目前，微球与待标记物连接方法主要有物理吸附和化学偶联。其中，化学偶联是利用活化交联剂将待标记物和微球通过化学反应连接在一起，连接后的稳定性较物理吸附更好(JL Ortega-Vinuesa et al.,Journal of Colloid&Interface Science,1995)。用于化学偶联的微球表面会修饰有一些化学基团，如羧基、氨基和羟基(对应于羧基微球、氨基微球和羟基微球)等。而在这些之中，羧基微球应用更为广泛。

利用活化剂制备羧基微球的方法是众所周知的，比如CN106353507A公开了一种将抗体偶联至微球的方法，该方法在用缓冲液重悬微粒后加入EDC和 sulfo-NHS活化反应15分钟，反应后离心清洗并超声重悬；随后将溶解的抗体与微粒混合再进行偶联反应，偶联后需再次进行离心清洗及重悬。又如 CN105606822A公开了一种使用抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒的方法，具体用 pH5.0的MES洗涤胶乳三次并超声分散，加入EDAC活化15分钟，洗涤2次并超声分散，然后依次加入抗体混合，封闭得到致敏颗粒。

然而，上述方法在制备过程中不仅需要进行离心以去除游离的活化剂和游离未结合的抗体，还需要对微球进行超声重悬以使其分散。这些步骤虽然去除了多余组分并解决了羧基微球制备时易凝集的问题，但使得操作过程变得效率低且耗时，不利于工业化制备。

针对这种情况，已提出了不需纯化的方法，例如在CN107167586A公开了这样的方法：先将胶乳加到缓冲液，在加入EDC进行活化15分钟，之后调节 pH至7.60，再加入SLO进行交联反应2h，最后加入两种封闭剂封闭得到成品的方法，该方法不需要进行离心或超滤步骤，从而提高制备效率。

但是，这一方法仍需要先用交联剂活化微球一段时间，之后还需要额外调节pH值后才能进行交联反应，这不可避免地延长制备时间、增加了操作的复杂度从而不便于在工业中应用。

因此，在免疫检测领域，仍然存在对操作更简单、耗时更短的羧基微球标记方法的需求。

发明内容

为此，本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单的羧基微球标记方法。另一方面进一步解决如何在羧基微球标记过程中防止微球凝集的问题。再一方面还解决了如何提高羧基微球的标记效率的问题。又一方面还解决了提高羧基微球的稳定性的问题。

为达到上述目的，本发明人对羧基微球的标记方法进行研究，并意外地发现通过调整微球稀释缓冲液和抗体稀释缓冲液的pH可以使得加入交联剂后(即对活化反应来说)，pH仍处于最适范围之内，这确保致敏后羧基微球具有更好的稳定性，从而无需对微球进行提前活化，也无需在加入交联剂后对pH进行额外的调整；在研究过程中，发明人还发现了至少通过减少交联剂预先活化这一步骤(即先将微球与待标记物接触混匀再加入交联剂使微球与待标记物交联)，降低了微球敏感性，使标记过程中不容易出现凝聚，从而不必要在标记过程中使用离心步骤和/或分散步骤。