[发明专利]一种sRNA干扰体系在甲基菌中的构建方法

说明书

本发明公开了一种sRNA干扰体系在甲基菌中的构建方法，首先利用转座酶将p15A质粒插入M.extorquens AM1和PA1中；sRNA干扰体系元件的扩增及载体构建；再进行目的基因的干扰及菌株筛选，最后荧光蛋白标记载体的构建及荧光蛋白基因的表达鉴定。本发明通过抑制竞争旁路代写途径的表达，优化代谢产物流，提高目标产物的表达水平。高效的基因表达技术对于次级代谢产物产量的优化提高有重要意义，可广泛应用于提高某种代谢产物产量研究。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种sRNA干扰体系在甲基菌中的构建方法。

背景技术

Methylobacterium extorquens(M.extorquens)AM1是一类甲基营养细菌，能够利用甲醇等一碳化合物作为唯一碳源合成高附加值的多碳有机物，具有很好的遗传代谢背景；但是其遗传操作手段相对单一，制约了外源生物合成途径的多元修饰改造。在已报导的外源基因高效表达的遗传操作手段中，常见的有核外高拷贝质粒表达的形式、以同源重组至染色体的方式、以及敲除竞争抑制途径的方式等，但是甲基营养菌由于其胞外多糖的干扰和核外复制质粒种类的限制，使得传统的基因工程操作技术过程与步骤繁琐耗时。

发明内容

本发明的目的在于提供一种sRNA干扰体系在甲基菌中的构建方法，本发明在AM1菌中引入sRNA(small RNA，)干扰技术，对AM1中通用质粒pCM80质粒进行了不必要的基因片段的删减，优化该质粒。通过抑制竞争旁路代写途径的表达，优化代谢产物流，提高目标产物的表达水平。高效的基因表达技术对于次级代谢产物产量的优化提高有重要意义，可广泛应用于提高某种代谢产物产量研究。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

步骤1,利用转座酶将p15A质粒插入M.extorquens AM1中；

步骤2，sRNA干扰体系元件的扩增及载体构建；

步骤3，目的基因的干扰及菌株筛选。

步骤4，荧光蛋白标记载体的构建及荧光蛋白基因的表达鉴定。

进一步，步骤2中sRNA干扰体系元件的扩增及载体构建方法，首先分别选取了大肠杆菌E.coli、甲基菌M.extorquens AM1和PA1来源的三种不同的Hfq蛋白基因hfqE、hfqA、hfqP，分别与MicC scaffold相连，克隆到出发载体pCM80上，设计针对靶基因lacZ的24bp的sRNA片段连接到上述三个载体之上，最终构建成用于sRNA干扰的载体pCM80-zmic-hfqA、pCM80-zmic-hfqE、pCM80-zmic-hfqP。

进一步，步骤3中目的基因的干扰及菌株筛选方法是将构建的sRNA载体转入带有LacZ基因的菌株AM1和PA1中，利用蓝白斑现象筛选目的菌株，并进行干扰效率的统计，筛选最优的sRNA干扰元件组合。

进一步，步骤4中首先将不同来源的荧光蛋白基因克隆到pCM80载体上，转化至甲基营养菌中，再将其克隆到sRNA干扰载体中，完成构建过程。

附图说明

图1是重组菌株的差异示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

发明材料：菌株：M.extorquens AM1、M.extorquens PA1、E.coli

实验试剂：培养基、抗生素(Tet、Km)、X-Gal、无菌水、实验用品试剂盒、各种酶试剂等。

实验器材：PCR仪、电转仪、紫外线分光光度计、高压灭菌锅、高分辨率的荧光成像显微镜仪器、恒温培养箱、摇床、水浴锅、超净工作台等。

实验方法：