[发明专利]罗非鱼脑细胞系及其应用

说明书

本发明公开了一种罗非鱼脑细胞系的构建方法，其步骤是：取鲜活罗非鱼消毒取脑组织，剪碎块，用胶原酶处理后，加入胰蛋白酶；用含培养液充分悬浮，进行原代培养；细胞长满瓶底时，用胰酶‑EDTA消化，接种传代培养；传代培养60代后，于对数生长期加入秋水仙素处理并进行核型分析。本发明公开的罗非鱼脑细胞系的制备方法，方法简单方便；并且用该方法制备的罗非鱼脑细胞系，可以进行长时间的传代培养，对罗非鱼出血病病毒非常敏感，可以广泛应用于实验中。

技术领域

本发明涉及生物细胞学领域，特别涉及一种罗非鱼脑细胞系及其应用。

背景技术

罗非鱼是世界第二大水产养殖品种，具有杂食性，对高密度养殖方式也具有超强耐受性。这种价格低廉、品质优良的鱼类已成为发展中国家人们重要的食物来源。联合国粮食及农业组织(FAO)数据显示，2015年，全球罗非鱼养殖和捕捞产量达到640万吨，价值约98亿美元，全球贸易额达到18亿美元。目前，中国、印尼和埃及是罗非鱼的三大主要生产国。其中，中国是罗非鱼的养殖大国，养殖产量约占世界总产量的50％，主要集中在广东、广西、海南和福建等地。

与其他鱼类比较，罗非鱼曾经以易养殖和抗病力强著称。然而，从2009年开始，以色列、厄瓜多尔、埃及、泰国等国家先后暴发了罗非鱼湖病毒(TilapiaLake Virus，TiLV)感染引起的传染病，导致大批野生和养殖罗非鱼死亡，造成严重的经济损失。

罗非鱼湖病毒病又称为罗非鱼合胞体肝炎(syncytical hepatitis of tilapia，SHT)，病原TiLV为近年来新发现的病毒，其分类地位尚未被确认。根据其生物学特性，目前TiLV被归类为正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的一种新的病毒。电子显微镜显示病毒粒子为具包膜的二十面体结构，大小为55～75nm。

TiLV是近年来出现的急性传染性病原。国外已经在病毒的细胞培养、组织病理学、PCR、原位杂交等检测技术方面进行了研究，并建立了相应的检测方法。世界卫生组织(OIE)推荐检测水产动物病毒的“黄金标准”是通过细胞来分离病毒。2014年，Marina Eyngo等将发生病变的病鱼器官匀浆，经0.22μm滤膜过滤后，分别与8种不同的细胞系(罗非鱼原代脑细胞、E-11、CHSE-214、BF-2、BB、EPC、KF-1、RTG-2和FHM)进行共孵育，发现该病毒能引起罗非鱼原代脑细胞和E-11细胞系(乌鳢成纤维细胞系)的细胞病变效应(CPE)，分别在共孵育后10-12d、5-7d后出现明显的CPE现象。前者表现为细胞由细长变肿胀、变圆，有颗粒形成，后者表现为胞浆空泡、蚀斑形成。Tsofack研究表明，TiLV可以在E-11、罗非鱼脑细胞原代细胞、OmB和TmB等细胞系进行培养，其中E-11细胞被认为是最合适的细胞系。OmB和TmB细胞对TiLV的感染滴度低于E-11，敏感性也不如E-11。然而，E-11细胞是来源于乌鳢的成纤维细胞，非罗非鱼的本源细胞，长期使用该细胞进行TiLV的增殖，易使病毒致弱，不利于TiLV的纯化及疫苗的研发工作。源于罗非鱼的细胞更有利于TiLV的纯化增殖及疫苗的研发。

国内针对TiLV的研究几乎是空白。很多罗非鱼疫病的病因未能彻底调查，无法明确TiLV在我国的感染情况，其中很大一个阻碍因素就是国内目前没有源于罗非鱼的对罗湖病毒的敏感细胞系，无法进行病毒的扩增纯化，无法为罗湖病毒的分离鉴定、诊断及疫苗的研发提供物质基础。

发明内容

本发明的目的在于公开一种罗非鱼脑细胞系的制备方法及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种罗非鱼脑细胞系的构建方法，其步骤是：取鲜活罗非鱼消毒取脑组织，剪碎块，用胶原酶处理后，加入胰蛋白酶；用含培养液充分悬浮，进行原代培养；细胞长满瓶底时，用胰酶-EDTA消化，接种传代培养；传代培养60代后，于对数生长期加入秋水仙素处理并进行核型分析。