[发明专利]一种衍生化的含游离氨基的硫酸类肝素二糖的分离分析方法

权利要求书

1.一种衍生化的含游离氨基的硫酸类肝素二糖的分离分析方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）将铵盐试剂溶解于去离子水中，用pH调节试剂调pH值至5.2-6.0，制得浓度为20mM-80mM的流动相A；将醇类试剂作为流动相B；

（2）将待测的硫酸类肝素二糖各自溶解于去离子水中，配制成浓度为1mg/mL的二糖溶液；取等量的12种二糖，配制成二糖混合物，冻干；

（3）将荧光疏水性的标记试剂溶于乙酸：二甲亚砜（v/v）=3：17的溶剂中，制得浓度为0.05-0.2mol/L的标记试剂溶液；将氰基硼氢化钠溶于去离子水中，制得浓度为0.5-2.0mol/L的氰基硼氢化钠溶液；

（4）用（3）中的标记溶液标记（2）中的干燥混合二糖，反应20min后，加入氰基硼氢化钠溶液，混合均匀，30-50℃水浴反应2-6小时；用50%(v/v)的二甲亚砜将上述标记的二糖混合物稀释到20-40ng/μL的二糖浓度，配制成多组不同二糖浓度的待测二糖溶液；

（5）将标记后的多组不同浓度的硫酸类肝素标准二糖用以下色谱条件进行分离：ODS-2HYPERSIL C18色谱柱，流速为0.3mL/min，洗脱梯度为0-100min：98%-80%流动相A、2%-20%流动相B，100min-120min：80%-50%流动相A、20%-50%流动相B；PDA检测器在200nm-600nm全波段检测的条件下检测分离色谱图；其中流动相A为铵盐溶液，流动相B为甲醇试剂；

（6）通过质谱检测得到质谱检测峰面积，计算出各种二糖的质量和质谱检测峰面积的函数关系，再计算出硫酸类肝素二糖的百分含量；

其中硫酸类肝素二糖具体为：DHexA(2S)–GlcNS(6S)、DHexA–GlcNS(6S)、DHexA(2S)–GlcNS、DHexA–GlcNS、DHexA(2S)-GlcNH₃⁺(6S)、DHexA(2S)–GlcNAc(6S)、DHexA-GlcNH₃⁺(6S)、DHexA–GlcNAc(6S)、DHexA(2S)-GlcNH₃⁺、DHexA(2S)–GlcNAc、DHexA-GlcNH₃⁺、DHex–GlcNAc。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的铵盐试剂为乙酸铵；pH调节试剂为乙酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的荧光疏水性标记物为2-氨基吖啶酮。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中的液相-质谱采用反相液相色谱串联电喷雾离子阱飞行时间质谱，设定参数为：负离子模式锥孔电压为-3.5kV，干燥气流速为1.5L/min，Heat block CDL温度为200℃。