[发明专利]一种蛋白的非还原肽图分析方法

说明书

本发明提供一种蛋白的非还原肽图分析方法，该方法首先利用变性剂对蛋白进行变性处理，然后酶解，酸终止反应后通过反向高效液相色谱进行检测。本发明的非还原肽图分析方法使得蛋白在酶解时更彻底，反向高效液相色谱检测中色谱峰均匀分布，出峰数目多，分离度好，且色谱图基线平稳，能够最真实反应蛋白酶解后的各肽段情况，对蛋白的质量控制具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物蛋白领域，具体涉及一种蛋白的非还原肽图分析方法。

背景技术

肽图分析(Peptide Mapping)是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶[一般为肽链内切酶(endopeptidase)]作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。肽图分析对多肽结构研究和特性鉴别具有重要意义。利用胰蛋白酶能特异性作用于Arg和Lys羧基端的肽链的性质，通过RP-HPLC法采用C18柱检测蛋白特征性胰肽图谱作为鉴定分析。肽图可以鉴别由于互补DNA读取错误或发生点突变而使单个氨基酸发生改变。肽图是一个比较的过程，因为需要将得到的信息，与参比标准或同样处理过的参比材料相比较来确定蛋白的一级结构，它能够检测到结构是否发生了改变，从而证明过程的一致性和基因的稳定性。此项技术在新药开发中得到广泛应用。

由于肽图能够提供丰富的结构信息，并且在一级结构上具有很多优点，已经逐渐成为抗体、蛋白或多肽类药物的常规指标。目前2015版中国药典四部中明确采用液相肽图对蛋白酶或化学物质裂解后的蛋白机芯分析鉴定蛋白质一级结构的完整性和准确性，然而药典方法对蛋白前处理未做规定，按照该方法进行肽图分析往往存在蛋白裂解不彻底的缺陷，而且药典方法中的梯度洗脱条件较为简短，使得色谱图中的肽段分离度差，往往不适用于结构复杂的蛋白或单抗的肽段分离。

发明内容

本发明为了解决现有技术中蛋白肽图分析存在的酶解不彻底，色谱峰分离度差、出峰数目较少等一系列缺陷，本发明一方面提供了如下肽图分析方法，其步骤包括：

1)样品处理：将蛋白加入变性试剂进行变性后，加入胰蛋白酶进行酶解，酸终止酶解反应；

2)反向高效液相色谱检测：对终止酶解后的样品进行反向高效液相色谱检测，检测条件为：

色谱柱：反向十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相A：0.1％三氟乙酸的水溶液；

流动相B：0.07-0.1％三氟乙酸的含水乙腈溶液，其中水的含量为10-30％；

流速：1ml/min，柱温30-60℃；

检测波长：214nm；

梯度洗脱程序为：

经发明人试验验证，本发明中流动相B中含水乙腈溶液中水含量为10-30％能够使得各肽段尽量多地分离。当水含量低于10％(如采用药典的流动相，其流动相B中不含有水)，各肽段的色谱峰出峰将过于密集，分离度不好；而当水含量超过30％，其洗脱时间将进一步延长，不利于疏水段肽段的完整分离。

经发明人试验验证，本发明的柱温选择在30-60℃色谱峰出峰数目在50个以上，说明在此柱温范围能够洗脱分离50个以上的肽段，且随着温度的升高，色谱峰出峰数目增加。而根据色谱柱的型号和规格，柱温最高不超过60℃。

本发明中使用的变性试剂为本领域常规的能够辅助蛋白酶解，使蛋白变性并舒展的试剂，如RapiGest SF、盐酸胍。

优选地，本发明的变性试剂选择RapiGest SF，浓度为0.1-0.2w/v％，更优选0.2w/v％。