[发明专利]基于AuNPs增强Na2

说明书

本发明公开了一种基于AuNPs增强Na₂S₂O₈/O₂的ECL效应的蛋白激酶检测方法，属于电致化学发光技术领域。将多肽修饰于玻碳电极表面，然后在蛋白激酶和巯基三磷酸腺苷的作用下，使得多肽发生磷酸化反应，之后加入AuNPs，通过Au‑S键作用将AuNPs连接到多肽的巯基磷酸化位点上，从而拉近了AuNPs与电极表面的距离，AuNPs良好的电子传导性使得Na₂S₂O₈/O₂体系的ECL信号大大增强，且ECL增强的强度与蛋白激酶浓度呈正相关，据此可实现蛋白激酶活性的高灵敏和选择性检测，并用于对蛋白激酶抑制剂的筛选。

技术领域

本发明涉及一种基于AuNPs增强Na₂S₂O₈/O₂的ECL效应的蛋白激酶检测方法，属于电致化学发光技术领域。

背景技术

蛋白激酶，又称蛋白质磷酸化酶，在蛋白质或多肽磷酸化的过程中发挥催化调节的作用。蛋白质或多肽的磷酸化反应主要发生在苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸残基侧链的羟基位点上，不同类型的蛋白激酶能够识别并修饰的蛋白质位点也有所不同。蛋白激酶A(PKA)，是目前所发现的具有最简单的生物结构以及最清楚生化特性的一种激酶，且活化的PKA可以识别蛋白质或多肽的丝氨酸残基侧链的羟基并催化其发生磷酸化，从而改变蛋白质或多肽的特性，最终影响有关基因的表达，而许多疾病以及癌症的发生都与PKA的异常表达有着紧密的联系。目前，蛋白激酶活性的测定方法主要有比色法、放射法、生物素/巯基标记法以及表面等离子共振法等，这些方法虽然能有效检测蛋白激酶的活性，但是存在偶联操作繁琐、标记步骤复杂且耗时等问题。因此，发展简单易行的蛋白激酶活性分析新方法具有重要意义。

电致化学发光(ECL)是在反应体系中施加一定的电压，发光试剂在电极表面发生氧化或还原反应形成激发态，激发态返回到基态过程中伴随着ECL信号的产生。ECL方法具有节约试剂、背景信号低、良好的时间和空间可控性以及易于分离目标物等优点，是一种有效的检测工具。发明人成功制备了生物素-DNA标记的葡萄糖氧化酶/AuNPs (GOx/AuNPs/DNA-biotin)纳米探针，利用生物素-亲和素作用，将GOx/AuNPs/DNA-biotin 组装到经PKA和三磷酸腺苷(ATP)作用的磷酸化多肽修饰电极上，放大了鲁米诺的ECL 信号并用于检测PKA活性(Liang R-P,Xiang C-Y,Zhao H-F,Qiu J-D.Highly sensitiveelectrogenerated chemiluminescence biosensor in profiling protein kinaseactivity and inhibition using amultifunctional nanoprobe.AnalyticaChimicaActa,2014,812,33-40)。金属纳米粒子的性质介于孤立的原子与大块材料之间，具有良好的水溶性、生物相容性、低毒性以及表面等离子共振等特性。AuNPs具有独特的结构以及量子尺寸效应、表面效应、体积效应等独特性能，成为材料学研究的热点，在生物分析领域有着广泛的应用。AuNPs可以提供大的电极界面面积，加速ECL发光体与电极之间的电子转移，放大ECL信号。Guo等人将两种不同的癌胚抗原(CEA)适配体分别修饰在二氧化硅掺杂的Ru(bpy)₃²⁺(Ru@SiO₂)与AuNPs表面，存在CEA时，可形成多分子层Ru@SiO₂-AuNPs结构，以Ru@SiO₂作为ECL发光体，AuNPs 作为局域等离子共振源用来增强ECL信号，通过ECL信号的增强效果检测CEA的浓度(Wang D,Li Y,Lin Z,Qiu B,Guo L-H.Surface-enhancedelectrochemiluminescence of Ru@SiO₂for ultrasensitive detection ofcarcinoembryonic antigen.Analytical Chemistry,2015,87(12), 5966-5972)。然而，基于AuNPs增强Na₂S₂O₈/O₂体系的ECL效应在蛋白激酶检测中尚未见报道。