[发明专利]一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条及其制备和使用方法

权利要求书

1.一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、制备核β-NaYF₄:Yb,Tm，其中β-NaYF₄:Yb,Tm中Yb元素的掺杂摩尔百分数为10％～99.8％，Tm元素的掺杂摩尔百分数为0.2％～10％：

a、按照β-NaYF₄:Yb,Tm的化学计量比与Yb和Tm的掺杂浓度称取氯化钇、氯化镱、氯化铥、氟化铵和氢氧化钠；

b、先将氯化钇、氯化镱与氯化铥混合于容器中，再加入油酸与十八烯，加热到150～180℃，保持30～50min，以去除其中的水分和氧气，冷却后，得到混合液；

c、将氢氧化钠和氟化铵溶于甲醇中，得到的溶液加入到步骤一得到的混合液中，室温保持30～50min，接着加热到70～100℃，保持30min，以去除其中的甲醇；接着加热到300～320℃，保持60-90min后，反应结束；

d、步骤c得到的液体自然降温后，转移到离心管中，加入乙醇超声震荡洗涤，再离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2-3次，得到β-NaYF4:Yb,Tm，将β-NaYF4:Yb,Tm分散在正己烷中，得到β-NaYF4:Yb,Tm分散液；

二、核壳结构β-NaYF₄:Yb,Tm@NaXF₄的制备，其中X＝Y或Lu：

e、将氧化钇或氧化镥溶于体积百分浓度为50％的三氟乙酸水溶液中，加热到90～100℃使其全部溶解，持续通入氩气使溶液完全挥发，在三口烧瓶底部可以得到白色粉末，即为制得三氟乙酸稀土盐；

f、待三口烧瓶底部的白色粉末完全干燥后，加入步骤一(d)制备的β-NaYF₄:Yb,Tm分散液、油酸和十八烯，在氩气保护下加热到120～150℃，保持30～60min，除去溶液中的氧气、水及正己烷，然后调整升温速率为12K·min^-1加热到300～320℃，保持60～90min，停止反应；

g、待步骤f得到的溶液自然冷却到室温，加入乙醇震荡洗涤，再离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2-3次，得到核壳结构β-NaYF₄:Yb,Tm@NaXF₄，将核壳结构β-NaYF₄:Yb,Tm@NaXF₄分散在正己烷中，得到β-NaYF₄:Yb,Tm@NaXF₄分散液；其中X＝Y或Lu；

三、组装稀土上转换发光探针：

h、将β-NaYF₄:Yb,Tm@NaXF₄分散液和NOBF₄的DMF溶液混合振荡，得到混合液；静置5～10min后再离心分离出固相沉淀，将固相沉淀再分散在DMF中，得到β-NaYF₄:Yb,Tm@NaXF₄的DMF分散液；

i、按β-NaYF₄:Yb,Tm@NaXF₄的DMF分散液中β-NaYF₄:Yb,Tm@NaXF₄与聚丙烯酸的摩尔比为1：(50～60)，向β-NaYF₄:Yb,Tm@NaXF₄的DMF分散液中加入聚丙烯酸，加热到80～100℃并保持30～60min，然后加入丙酮，静置后离心分离，将沉淀分散到水中，得到聚丙烯酸包覆的纳米晶的水分散液；

j、向聚丙烯酸包覆的纳米晶的水分散液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，其中水分散液中聚丙烯酸包覆的纳米晶与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：(120～130)，水分散液中聚丙烯酸包覆的纳米晶与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(25～35)，升温至37℃的条件下反应4h后，离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到活化的聚丙烯酸包覆的纳米晶分散液；

k、取活化的聚丙烯酸包覆的纳米晶分散液，加入血清标记物抗体溶液，其中活化的聚丙烯酸包覆的纳米晶分散液中的活化的聚丙烯酸包覆的纳米晶与血清标记物抗体的摩尔比为1：(50～60)，在37℃的条件下反应6h后，离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到结合抗体的上转换β-NaYF₄:Yb,Tm@NaXF₄纳米晶探针的水分散液；

l、取活化的聚丙烯酸包覆的纳米晶分散液，加入鼠IgG溶液，其中活化的聚丙烯酸包覆的纳米晶分散液中的活化的聚丙烯酸包覆的纳米晶与鼠IgG的摩尔比为1:60，在37℃的条件下反应6h后，离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到结合鼠IgG的上转换β-NaYF₄:Yb,Tm@NaXF₄纳米晶探针的水分散液；

四、组装基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条：

m、以Tris缓冲液为溶剂，以S9表面活性剂、酪蛋白、PVP-K30、Tween-20为溶质配制混合溶液，将玻璃纤维膜在混合溶液中浸泡2～4h，干燥，得到样品垫(4)；

n、用浓度为10mmol/L的柠檬酸钠缓冲液为溶剂，以蔗糖、结合抗体的上转换β-NaYF₄:Yb,Tm@NaYF₄纳米晶探针的水分散液、结合鼠IgG的上转换β-NaYF₄:Yb,Tm@NaXF₄纳米晶探针的水分散液为溶质配制探针溶液；探针溶液中，蔗糖的质量百分浓度为1％～1.2％，结合抗体的上转换β-NaYF₄:Yb,Tm@NaXF₄纳米晶探针的水分散液的体积百分浓度为10％～50％，结合鼠IgG的上转换β-NaYF₄:Yb,Tm@NaXF₄纳米晶探针的体积百分浓度为10％～30％；将玻璃纤维膜在探针溶液中浸泡，然后在45～50℃下干燥，得到结合垫(3)；

o、用1～2mg/mL的血清标记物抗体溶液按滴加体积量是1～1.2μL/cm在硝化纤维膜上画出宽度是1～1.2mm的画线，得到检测线(2-2)；再用1～2mg/mL的鼠IgG抗体溶液按滴加体积量是1～1.2μL/cm在硝化纤维膜上画出平行于检测线的宽度是1～1.2mm的画线，得到控制线(2-32)，得到检测垫(2)；

p、将检测垫(2)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)的中部，在检测垫(2)的检测线(2-2)一侧，将结合垫(3)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)上，并使结合垫(3)与检测垫(2)搭接，样品垫(4)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)上并使样品垫(4)与结合垫(3)搭接；在检测垫(2)的控制线(2-32)一侧，将吸收垫(5)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)上并使吸收垫(5)与检测垫(2)搭接，得到基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条。