[发明专利]一种幼年大鼠视网膜色素上皮细胞分离培养方法

说明书

本发明公开了一种幼年大鼠视网膜色素上皮细胞分离培养方法；包括以下步骤:(1)取大鼠眼球用0.02mg/mL Dispase酶消化处理；(2)解剖眼球，去除角膜、晶体和脉络膜组织，分离视网膜，并剪成视网膜片，将视网膜片放入培养箱中孵育，孵育结束后，使视网膜片在培养皿内流动，促进视网膜上皮细胞片与视网膜片分离；(3)吸取分离后的视网膜上皮细胞片，在含PBS的培养皿中清洗；(4)清洗后的视网膜上皮细胞片转移到新的含PBS的培养皿中，加入胰酶消化、吹打，再种植于细胞培养皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。与现有技术相比，本发明方法具有无杂细胞污染，无需人为机械分离操作，过程简易，分离时间短的特点。

技术领域

本发明涉及细胞分离培养技术领域，尤其是一种幼年大鼠视网膜色素上皮细胞分离培养方法。

背景技术

视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)是视网膜外部的单层细胞，因其多边形形态和胞质内丰富的黑色素而得名，它们在视网膜细胞的维持和自我更新上发挥重要的功能，如：吞噬消化脱落的光感受器细胞外节盘膜；促进视循环中11-顺视黄醛的再生；分泌神经营养因子；参与形成视网膜-血管屏障等。RPE细胞的这些生理功能异常被认为与相关眼科疾病的发生密切相关，如年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)和莱伯氏先天性黑蒙症(Leber congenital amaurosis,LCA)等。

RPE细胞具有极性，其基底膜与Bruch膜相连构成Bruch膜内层，其顶部微绒毛和感光细胞外节相连。在成年大鼠中RPE细胞基底面和Bruch膜连接紧密，RPE细胞微绒毛和感光细胞外节连接紧密，这些都使得RPE细胞的分离变得困难。由于新生大鼠(出生后2周内)感光细胞外节还未发育完全，其与RPE细胞易于分离。因此大多数方法均选择在这一时间段内，但也有成年大鼠的RPE细胞分离方法的报导。目前已有报导使用木瓜蛋白酶(papain)、胶原酶(collagenase)和Dispase分散酶等多种方法分离新生大鼠的RPE细胞。这些已有的从新生大鼠中分离RPE细胞的方法均采用机械方法将RPE细胞从视网膜上剥离，操作所需时间长，难度大，并且容易造成视网膜相关细胞污染。

此外，这些方法使用的均是色素大鼠，由于其RPE细胞含黑色素，便于机械分离时识别RPE细胞和视网膜。对于白化大鼠而言这些方法的局限更加明显，由于白化大鼠的RPE细胞不含色素，难于与视网膜区分开来，目前还没有分离新生白鼠RPE细胞的报导。

发明内容

本发明针对已有方法的不足，进而提供一种幼年大鼠视网膜色素上皮细胞分离培养方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种幼年大鼠视网膜色素上皮细胞分离培养方法，包括以下步骤:

(1)取大鼠眼球用0.02mg/mL Dispase酶消化处理；

(2)解剖眼球，去除角膜、晶体和脉络膜组织，分离视网膜，并剪成视网膜片，将视网膜片放入培养箱中孵育，孵育结束后，轻轻摇培养皿使视网膜片在培养皿内流动，促进视网膜上皮细胞片与视网膜片分离；

(3)吸取分离后的视网膜上皮细胞片，清洗；

(4)清洗后的视网膜上皮细胞片转移到新的含PBS的培养皿中，加入胰酶消化、吹打，再种植于细胞培养皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)所述大鼠为白化大鼠，视网膜色素上皮细胞无色素。需要说明的是本发明的方法也同样适用于色素大鼠，只是对于难以用常规方法处理的白化大鼠更为适用。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)所述大鼠为新生10天大鼠。

在本发明的一个实施方式中，将大鼠脱颈处死，无菌条件下取出眼球。