[发明专利]一种靶向多发性骨髓瘤多种抗原的嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种针对多发性骨髓瘤多种抗原(包括BCMA、CS1、CD138、CD38和Integrin β7)的嵌合抗原受体T细胞的构建方法与应用。本发明利用piggybac转座系统，构建多靶向CAR表达框架，通过电转染方法使其导入T细胞并验证其已插入基因组。本发明提供了一种多靶向多发性骨髓瘤的CAR‑T细胞构建的新型方法。

一、技术领域

本专利属于生物技术工程领域，具体涉及到针对多发性骨髓瘤(MM)多种靶点(包括BCMA、CS1、CD138、CD38和Integrinβ7)的嵌合抗原受体T细胞的构建与应用。

二、技术背景：

多发性骨髓瘤(MM)是以克隆性浆细胞大量增生为特征的恶性肿瘤，目前以化疗和靶向药物治疗为主，但是目前仅能缓解病情而无法治愈。MM在我国的发病率约为十万分之一至十万分之二，已经超过急性白血病，位居血液系统恶性肿瘤发病率的第二位。然而，大家对MM的认知程度普遍偏低，目前全球仅有2种化疗药物可以缓解病痛但无法治愈。更严峻的是，不少患者对化疗药物产生耐药性，导致他们的生存期只有九个月。尽管一些单克隆抗体已经在临床前研究和早期临床试验中显示出治疗MM的希望，但并没有得到一致性认可。显然，研发针对MM的新型治疗方法是迫切需要的。

CAR-T疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方案。其通过体外基因转移技术，将编码嵌合抗原受体(CAR)的基因序列转导入T细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞。针对多发性骨髓瘤的相关抗原主要包括：BCMA、CS1、CD138、CD38和Integrinβ7。CS1是一种细胞表面糖蛋白，在正常的浆细胞和超过95％的MM患者细胞中高表达，而且有文献报道复发的MM患者细胞表面同样有CS1的表达；CD138，亦称作syndecan-1，作为位于细胞外基质中的粘附蛋白，在结合胶原和纤连蛋白分子中起作用，CD138在MM肿瘤细胞表面几乎均有表达，所以这两种分子均都可成为治疗MM非常有吸引力的靶标。虽然CD138表达于上皮细胞，但是在2016年，来自中国人民解放军总医院的一份报告表示用anti-CD138 CAR-T治疗的几位化疗难治性MM病人均未产生上皮细胞毒性，这也间接为患者生命安全提供了保障；B细胞成熟抗原(BCMA)是特异表达在MM细胞上的受体蛋白，除浆细胞外，BCMA蛋白在正常组织上和CD34+的造血细胞均未未检出。BCMA属于TNF受体超家族，其可以结合B细胞活化因子以及增殖诱导配体，从而促进MM细胞生长和骨髓基质细胞的黏附，BCMA抗体对MM细胞系和原代MM细胞都具有杀伤作用，而且已有研究证明抗BCMA CAR-T细胞治疗MM的有效性；CD38是一种单链II型跨膜糖蛋白，有多项研究表明CD38在骨髓瘤细胞表面几乎都有表达，且美国食品药品监督管理局(FDA)已经批准运用单克隆抗体药物daRatumumab(CD38单抗)治疗MM，这一结果也支持了CD38作为合适靶点的观点，同时提示CD38可作为MM的CAR-T免疫疗法的潜在靶抗原。

Piggybac转座系统是来源于鳞翅目昆虫Trichoplusia ni.的DNA转座子，最初是在杆状病毒(Baculovirus)侵染粉纹夜蛾TN-368细胞株时首次分离得到的。PiggyBac转座子可插入到基因组TTAA位点，目前已经证实在小鼠、猪和人的基因组中，PiggyBac转座子可以高效转座，且其插入目的基因组中时对携带的外源基因大小没有限制，我们可以利用这点突破腺病毒，腺相关病毒，慢病毒对外源基因承载量的限制，从而构建针对多发性骨髓瘤的多靶向CAR-T细胞。

三、发明内容：

本发明主要是基于针对运用靶向药物治疗MM的患者易耐药，易复发以及单靶向CAR-T可能存在抗原逃逸的难题提供了一种针对MM的多靶向的嵌合抗原受体T细胞的构建方法。

通过基因工程技术构建anti-CS1&CD138&BCMA、anti-CS1&CD138等piggybac转座系统载体，然后利用电转的方法，将piggybac转座系统转染入T细胞，培养两天后通过流式检测CAR的表达；并提取T细胞基因组DNA，利用Splinkerette PCR验证有CAR分子插入基因组。