[发明专利]一种在MDCK全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种在MDCK全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法及其应用。所述方法包括：将MDCK细胞全悬浮培养至7.0×10⁶～1.0×10⁷cells/mL时，按MOI＝0.001～0.0001接种鸡胚禽流感病毒；接毒后在pH值6.9～7.3、溶氧30～60％、温度32～37℃的环境下培养，当病毒达到足够高的滴度后分离并提纯病毒粒子。本方法由于种毒无需循环，因而缩短了生产周期，且种毒变异风险大大降低。通过本发明提供的方法培养重组禽流感病毒的HA能够达到1:1024，每1ml病毒含量≥10^8.0TCID₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^8.0TCID₅₀，而种毒的接入量量减少10倍以上。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种在MDCK全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法及其应用。

背景技术

现有的重组禽流感病毒在MDCK悬浮细胞上增殖方法，主要是采用鸡胚种毒在贴壁生长的MDCK细胞上进行5-10代的传代驯化，使病毒逐渐适应在贴壁细胞上增殖，然后将在贴壁细胞上驯化适应好的贴壁毒接种至悬浮细胞上再进行1-3代的传代驯化，适应了悬浮细胞的病毒才能投入至大生产进行抗原的生产，整个的种毒驯化过程需要耗费大量的人力物力，驯化时间也较长(3-6个月)，即使驯化完成后种毒的接入量也会较大(0.1％-0.3％)。再者由于禽流感病毒有16个HA亚型和9个NA亚型比较容易发生变异，通过在细胞上连续进行传代后其免疫原性可能发生不可逆转的改变。

综上所述目前所使用的这种重组禽流感病毒在MDCK悬浮细胞上增殖方法不仅较为复杂，而且病毒的驯化周期也会比较长，不利于流感大流行时疫苗的及时稳定的供应，最终病毒在细胞上连续传代其免疫效果也难以得到保证。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在MDCK全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法，所述的方法简单，种毒无需驯化，扩繁后即可使用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种在MDCK全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法，包括：

将MDCK细胞全悬浮培养至7.0×10⁶～1.0×10⁷cells/mL时，按MOI＝0.001～0.0001接种鸡胚禽流感病毒；

接毒后在pH值6.9～7.3、溶氧30～60％、温度32～37℃的环境下培养，当病毒达到足够高的滴度后分离并提纯病毒粒子。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

由于种毒无需循环，因而缩短了生产周期，且种毒变异风险大大降低。通过本发明提供的方法培养重组禽流感病毒的HA能够达到1:1024，每1ml病毒含量≥10^8.0TCID₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^8.0TCID₅₀，而种毒的接入量量减少10倍以上。

本发明所提供的MDCK细胞系，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学中国典型培养物保藏中心。培养物名称(分类命名)：犬肾细胞MDCK-G01。

具体实施方式

本发明涉及一种在MDCK全悬浮细胞上增殖禽流感病毒的方法，包括：