[发明专利]表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行CNE10基因敲除

说明书

本发明提供了一种采用CRISPR‑cas系统针对表皮干细胞进行CNE10基因编辑，特别是涉及一种构建CNE10基因敲除的表皮干细胞细胞系的建立。其中构建并获得了两个特异的gRNA，能够显著提高表皮干细胞内CRISPR/Cas9针对CNE10的基因编辑效率。本发明提供的表皮干细胞CNE10敲除质粒具有较好的遗传稳定性以及较高的打靶效率。

技术领域

本发明提供一种采用CRISPR-cas系统针对表皮干细胞进行CNE10基因编辑，特别是涉及一种构建CNE10基因敲除的表皮干细胞细胞系的建立。

背景技术

表皮干细胞(Epidermal stem cells，EpiSCS)是具有自我增殖和多向分化潜能的干细胞，它的正常增殖和分化是维持皮肤及其附属器(汗腺毛发、皮脂腺)结构和功能完整性的基本要求。在生理条件下，表皮干细胞通过不对称分裂方式分化为一个干细胞和一个短暂扩充细胞(transit amplifying cellsTA细胞)，TA细胞再经过多次分裂后分化为有丝分裂后细胞(Post-mitotic cells)及终末分化细胞(terminally-differentiatedcells)，以补充表皮细胞不断更新的需要。研究表明表皮干细胞不仅能在体外长期传代培养，并保持其增殖分化潜能(Dunnwald et al，Exp Dermatol，2001，10：45-54.Papini etal.stem cells，2003，21：481-494)，而且，在一定环境条件下还表现出与胚胎干细胞相似的分化潜能[Liang et al，stem cells，2002：20：21-31]。因此，获得纯化的表皮干细胞不仅可为构建有生理功能的人工皮肤提供种子细胞，而且可用于基因治疗和转基因动物的生产。

人类多能干细胞(Human pluripotent stem cells,hPSCs)和基因组编辑技术结合所建立的细胞模型，为疾病研究提供了一个独特的实验平台。利用这个平台体系，研究人员可以研究特定基因突变甚至染色体结构变异对人类多种细胞类型和组织器官功能的影响及其详细的分子机制，并可建立携带不同遗传突变的“个性化”疾病模型用于大规模药物筛选。该模型体系的建立得益于基因组编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins9,CRISPR/Cas9)技术的飞速发展。

保守非编码元件(Conserved noncoding DNA elements，CNEs)矮小同源盒基因(SHOX基因)随着后基因组学(功能基因组学)的到来，脊椎动物基因组的非编码DNA序列的功能鉴定与特征研究已成为后基因时代的挑战与研究热点。随着实验技术的进步和发展，这些过去被当作是垃圾的CNEs，现在却被认为具有重要的生物学功能。虽然CNEs不编码蛋白质、rRNA、tRNA或ncRNA及与转录和翻译相关的化学物质等，但有研究发现，CNEs在高级结构(染色质构型、蛋白的修饰等)、RNA的翻译及加工过程和DNA转录水平等对基因的表达进行远距离调控，并且还被证实与人类疾病和哺乳动物的各色各样的外表形态有关。随着对CNEs研究的逐步深入，发现大量疾病的发生是由于CNEs的改变，如孤独症、Rett综合征及胰腺发育不全均被证实致病基因内部或侧翼区的CNEs对其相关基因有调控作用。同样在Leri–Weill软骨发育异常、Langer肢中部发育不良和特发性矮小中均报道SHOX基因(矮身材含同源异型盒基因——short stature homeobox containing gene，SHOX)内部和(或)上、下游PAR1包括SHOX增强元件有突变或者缺失，说明CNEs对该基因有调控作用。