[发明专利]一种人弓形虫抗体检测的间接ELISA试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种人弓形虫抗体检测的间接ELISA试剂盒，其特征在于：包括重组抗原GRA15预包被板、样品稀释液、阳性参照血清、阴性参照血清、酶结合物、封闭液、洗涤液、显色液和终止液，所述重组抗原GRA15的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的一种人弓形虫抗体检测的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液为0.2％w/v BSA的磷酸盐缓冲液，酶结合物为HRP标记的山羊抗人IgG，封闭液为2％w/v BSA的碳酸盐缓冲液，洗涤液为0.05％v/v Tween-20的磷酸盐缓冲液，显色液为TMB-H₂O₂显色液，终止液为9.8％wt的硫酸溶液。

3.一种权利要求1或2所述人弓形虫抗体检测的间接ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)弓形虫重组GRA15蛋白的表达：运用PCR技术扩增我国分离的Chinese1型弓形虫虫株的GRA15基因，将其克隆入原核表达载体，构建重组质粒，经PCR、双酶切和序列测定鉴定分析；

(2)弓形虫重组GRA15蛋白的纯化：将构建完毕的重组质粒转化到宿主中，经IPTG诱导后，重组菌裂解，取上清，使用Ni-NTA树脂纯化；

(3)抗原包被：将纯化的重组蛋白GRA15用包被液稀释至20μg/mL，包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃过夜；用洗涤液清洗；加入封闭液，每孔100μL，温箱1h；随后再次用洗涤液洗涤，4℃保存备用。

4.根据权利要求3所述的一种人弓形虫抗体检测的间接ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述PCR的引物为

F：TATCTGAGGATAATGCTTTGGCTTG

R：ACGGATCCTCATGGAGTTACCGCTGAT。

5.根据权利要求4所述的一种人弓形虫抗体检测的间接ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述PCR的退火温度为62～66℃。

6.根据权利要求3所述的一种人弓形虫抗体检测的间接ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的载体为pET-28a。

7.根据权利要求3所述的一种人弓形虫抗体检测的间接ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。

8.根据权利要求3所述的一种人弓形虫抗体检测的间接ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述使用Ni-NTA树脂纯化包括以下步骤：

(21)灌柱：去除纯化柱空壳，塞住底端，上下颠倒充分混匀Ni-NTA，按树脂悬浊液与柱体积比为1:4，将树脂悬浊液加入纯化柱空壳内，垂直放置，待Ni-NTA自然沉降后打开塞子，上清完全流出后即可使用；

(22)预平衡：加入6倍Ni-NTA无菌去离子水，重悬树脂凝胶，待液体流净，再加入6倍Ni-NTA结合缓冲液，待液体流净；

(23)纯化回收：将来源于细胞破碎产物的上清液加入纯化柱中，按5倍Ni-NTA体积分五次加入，然后依次加入20倍Ni-NTA体积结合缓冲液、12倍Ni-NTA体积1:17稀释后的清洗缓冲液，弃去流穿液，流速控制在1mL/min；

(24)蛋白洗脱：分四次加入4倍Ni-NTA体积洗脱缓冲液，收集洗脱液于EP管中，整个过程在冰上操作。

9.根据权利要求8所述的一种人弓形虫抗体检测的间接ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于：所述结合缓冲液为40mM咪唑溶液，清洗缓冲液为80mM咪唑溶液，洗脱缓冲液为1M咪唑溶液。

10.根据权利要求3所述的一种人弓形虫抗体检测的间接ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的包被液为0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液。