[发明专利]奶牛瘤胃菌群的体外培养及保存方法

权利要求书

1.奶牛瘤胃菌群的体外保存方法，其特征在于，向奶牛瘤胃液或其体外培养物中按4％的添加量加入脱脂乳粉，然后冷冻干燥，得到瘤胃液冻干粉，于4℃或室温密封避光保存；

所述冷冻干燥的步骤为：第一步，-80℃预冻2-4h；第二步，真空度10-12Pa，温度-40--60℃，真空干燥48-60h；

其中，奶牛瘤胃液体外培养物的制备方法如下：利用双外流连续培养系统进行奶牛瘤胃菌群的体外培养，具体方法为：将750mL新鲜的奶牛瘤胃液作为接种物接种至已预热并经CO₂饱和的发酵罐中，发酵罐的有效容积为780mL；开启搅拌和CO₂通气装置，气流量为35-45mL/min，以瘤胃液供体牛的TMR日粮作为发酵底物，投料量为36-80g/天，分4-6次等量投料，并向双外流连续培养系统中输入缓冲液，将液相消化糜外流速度和固相消化糜外流速度分别控制在4-10％/h和2-7％/h，38.5-40℃发酵培养4-10d，收集流出的固相和液相消化糜振荡混匀，纱布过滤，获得含瘤胃菌群的培养物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述奶牛瘤胃液体外培养物的制备方法中，以转速25-30rpm进行搅拌，运行方式为搅拌25分钟，间歇5分钟。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述奶牛瘤胃液体外培养物的制备方法中，输入缓冲液的流速为1.3mL/min，流过滤网的液相消化糜流速为0.65mL/min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述奶牛瘤胃液体外培养物的制备方法中，所述瘤胃液供体牛为产3-4胎，泌乳天数60-80d的荷斯坦奶牛。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述奶牛瘤胃液体外培养物的制备方法中，收集流出的固相和液相消化糜，在振荡器中间歇振荡混匀3-4次，每次振荡10-15秒，通过双层纱布过滤，获得含有瘤胃菌群的培养物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述奶牛瘤胃液体外培养物的制备方法中，所述缓冲液的配制方法如下：

取标准缓冲液A 2400mL加入到25L容器中，加入水17435mL，再加入矿物盐溶液B120mL，250.0g/L尿素溶液40mL，搅拌均匀，并以无氧CO₂饱和，使用前加入半胱氨酸盐酸盐5g；

其中，所述标准缓冲液A的配方为：NaHCO₃ 24.5g/L、KHCO₃ 29.0g/L、NaH₂PO₄9.0g/L、KH₂PO₄ 10.2g/L；所述矿物盐溶液B的配方为：NaCl 47.0g/L、KCL 57.0g/L、MgCl₂·6H₂O12.8g/L、CaCl₂·2H₂O 5.3g/L。