[发明专利]一种免疫球蛋白制剂的纯化方法

说明书

本发明公开一种免疫球蛋白制剂的纯化方法，特别是一种破伤风马免疫球蛋白F(ab’)₂制剂的纯化方法。本发明的免疫球蛋白制剂纯化方法，是将待处理的蛋白用免疫亲和层析进行纯化。本发明方法与现有技术相比更具专一性、高效性、特异性，制备得到的破伤风马免疫球蛋白F(ab’)₂制剂具有高效价、高比活性的特点，且在生产中不依赖于高效价的原料血浆，提高了血浆的利用率，降低了血浆生产企业的成本。

技术领域

本发明涉及一种蛋白制剂的纯化方法，确切讲本发明涉及一种免疫球蛋白制剂的纯化方法，特别是一种破伤风马免疫球蛋白F(ab’)₂制剂的纯化方法。

背景技术

破伤风(Tetanus)是破伤风梭菌经由皮肤或黏膜伤口侵入人体，在缺氧环境下生长繁殖，产生毒素而引起肌痉挛的一种特异性感染。因各种原因造成深部创伤的患者，均给予预防或治疗破伤风的药物，一般为破伤风抗毒素。破伤风抗毒素是由破伤风类毒素免疫马所得的血浆，经胃酶消化后纯化制成的液体抗毒素球蛋白制剂。

破伤风抗毒素的生产具有悠久的历史，其生产技术也一直发展变化。破伤风抗毒素的制造方法前后经历过三个发展阶段，最初阶段的“原制血清”制品质量差，不良反应发生率高。第二个阶段制备的“浓制血清”，去除了大部分杂蛋白并使抗毒素蛋白得到了一定的浓缩，质量有较大的改进。第三个阶段是精制抗毒素阶段，自20世纪30年代创建，引入了胃酶消化，加温变性工艺，20世纪80年代在此基础上引入了超滤技术，把胃酶消化、硫酸铵盐析、超滤技术组成一个新的抗毒素生产工艺，即为现有技术中的硫酸铵沉淀工艺，此工艺使制品的外观、透明度、纯度等均有了较大的提高。(参见《医学生物制品学》，第二版，人民卫生出版社，1144)

现有技术中的硫酸铵沉淀工艺是生产破伤风抗毒素的通用方法。其原理为高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。该工艺属于粗放提纯过程，纯化的破伤风抗毒素蛋白含量高、比活性低。

随着层析技术的发展，在硫酸铵沉淀工艺基础上增加离子交换层析技术，破伤风抗毒素随之升级换代为破伤风马免疫球蛋白F(ab’)₂。离子交换层析是利用蛋白质所带电荷的不同来分离蛋白质，采用不同的pH和(或)离子强度的缓冲液洗脱，使带不同电荷的蛋白质分离。增加离子交换层析工艺后，产品比活性得到了一定幅度的提高，但离子交换层析工艺属于非特异性吸附，不具有专一性，产品的比活性提高幅度有限。关于离子交换层析工艺参见申请号为201610492044.X、名称为《一种无防腐剂的马破伤风免疫球蛋白制剂及其制备方法》的中国发明专利申请。

发明内容

本发明提供了一种克服现有技术不足的蛋白制剂的纯化方法。

本发明的免疫球蛋白制剂的纯化方法是将经胃酶消化、硫酸铵沉淀、超滤处理后的蛋白用免疫亲和层析进行纯化。

本发明所述的免疫球蛋白制剂的纯化方法特别适用于破伤风马免疫球蛋白F(ab’)₂。

优选地，本发明所涉及的免疫球蛋白是破伤风马免疫球蛋白F(ab’)₂，其免疫亲和层析所用的层析介质为破伤风类毒素与载体偶联。本发明优先的载体为预活化的琼脂糖凝胶，特别是NHS-activated Sepharose 4Fast Flow、CNBr-activated Sepharose 4B、Epoxy-activated Sepharose 6B、CNBr-activated Sepharose 4FastFlow、CNBr-activated Sepharose 6MB、CNBr-activated Bestarose 4FastFlow、CNBr-activatedBestarose 4B、NHS-activated Bestarose 4FastFlow或Epoxy-activatedBestarose 6B。