[发明专利]一种含有EGFP-Purα融合基因的慢病毒载体及其构建方法

说明书

本发明属于载体构建技术领域，具体涉及一种含有EGFP‑Purα融合基因的慢病毒载体及其构建方法。所述慢病毒载体包括EGFP‑Purα基因序列、慢病毒载体pLKO.1‑puro的基本序列、AgeI酶切位点、Eco RI酶切位点。所述构建方法为首先制备获得EGFP‑Purα基因，将EGFP‑Purα基因亚克隆到pLKO.1‑Puro慢病毒载体上，制备获得pLKO.1‑puro‑EGFP‑Purα慢病毒载体。本发明构建获得的pLKO.1‑puro‑EGFP‑Purα慢病毒载体可以广泛地应于到神经系统来源的细胞的实验研究，以克服神经系统来源的细胞用化学转染效率不高的问题，为深入研究Purα蛋白在神经系统的功能提供了一种有效的手段。

技术领域

本发明属于载体构建技术领域，具体涉及一种含有EGFP-Purα融合基因的慢病毒载体及其构建方法。

背景技术

Purα是一个多功能蛋白，其蛋白家族成员的序列从细菌到人是非常保守的。它以一种特异性的方式(结合于富含GC区域的GGN重复序列)结合于单链DNA和RNA。

Purα在DNA复制和基因转录方面起着多种重要的作用，它是一种在RNA分隔式翻译中的重要元件。Purα是一种广泛表达的蛋白质，然而它显示出了对发育和组织特异性的调控作用。例如，在小鼠大脑胚胎发育时期，Purα蛋白的表达很低，然而在出生后的第一周，它的表达迅速升高并在第18天达到高峰，然后Purα维持在一个相对较高的表达水平直到成年。此外，除了它在核内的功能之外，Purα在神经元细胞的胞浆中的含量也很丰富。特别是在突触的分支点处，Purα、聚核糖体和核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)以一种复合体的形式存在。Purα还作用于基因组稳定性的维持，在特异性的组织中有特异性的表达。在中枢神经系统，已经证实了Purα主要参与与mRNA转运和翻译有关的特异性机制。近来的其它研究也发现，Purα的突变可在5q31.3微缺失综合症的患者引起明显的新生儿肌张力缺陷，癫痫和脑病，Hunt D等，通过全基因组测序发现Purα蛋白的新生突变是神经认知功能障碍的重要原因，可引起明显的神经系统发育迟缓和学习能力的缺失。此外也有研究发现Purα与前列腺癌病人的内质网应激反应以及细胞分化有关，作为核转录因子，Purα蛋白还与神经细胞的RNA颗粒结合并抑制蛋白的翻译。

由于Purα转基因小鼠在出生后的第四周随即死亡，这就对Purα的功能研究造成了一定的困难。虽然已经人构建了来自转基因小鼠Purα-/-和对照小鼠Purα+/+原代培养的胚胎成纤维细胞(mouseembryo fibroblast,MEF)实验模型，在一定程度上可以对Purα的功能进行相应的研究，但是这种MEFs毕竟不是神经系统来源的细胞，对于神经系统的研究仍然有一定的局限性。

因此，现有技术中存在的缺点:

(1)无法得到Purα基因敲除的成年小鼠，这对研究Purα的功能和作用造成一定的困难；

(2)神经细胞难于用普通的方法进行转染，转染效率非常低，常常达不到实验的要求。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种含有EGFP-Purα融合基因的慢病毒载体及其制备方法。构建获得的pLKO.1-puro-EGFP-Purα慢病毒载体可以广泛地应于到神经系统来源的细胞的实验研究，以克服神经系统来源的细胞用化学转染效率不高的问题，为深入研究Purα蛋白在神经系统的功能提供了一种有效的手段。并且该慢病毒载体含有EGFP荧光蛋白，可以更直观地在荧光显微镜下观察，使得未来的有关实验更为简便和直观。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种含有EGFP-Purα融合基因的慢病毒载体，所述慢病毒载体包括EGFP-Purα基因序列、慢病毒载体pLKO.1-puro的基本序列、AgeI酶切位点、Eco RI酶切位点。