[发明专利]一种检测新型鹅星状病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒及应用有效
申请号: | 201810495165.9 | 申请日: | 2018-05-22 |
公开(公告)号: | CN108956985B | 公开(公告)日: | 2021-08-06 |
发明(设计)人: | 刁有祥;唐熠;刘赫 | 申请(专利权)人: | 山东农业大学 |
主分类号: | G01N33/569 | 分类号: | G01N33/569 |
代理公司: | 济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业) 37240 | 代理人: | 李茜 |
地址: | 271018 *** | 国省代码: | 山东;37 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 检测 新型 星状 病毒 抗体 间接 elisa 试剂盒 应用 | ||
1.一种检测新型鹅星状病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述间接ELISA检测试剂盒包含包被有新型鹅星状病毒ORF1b蛋白重组抗原的酶标板;
所述新型鹅星状病毒的保藏编号为CCTCC NO:V201808;
所述新型鹅星状病毒ORF1b蛋白重组抗原的制备方法如下:
以保藏编号为CCTCC NO:V201808的新型鹅星状病毒的全基因序列为模板,利用引物对扩增得到ORF1b基因片段,构建重组表达载体,通过原核表达系统表达新型鹅星状病毒ORF1b蛋白重组抗原;
所述引物对的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;
将所述重组表达载体转化至BL21感受态细胞中,加入IPTG进行诱导表达;将表达产物经过变性和复性后,获得纯化的新型鹅星状病毒ORF1b蛋白重组抗原;
所述新型鹅星状病毒ORF1b蛋白重组抗原的包被量为500ng/孔。
2.根据权利要求1所述的间接ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述间接ELISA检测试剂盒还包含:酶标抗体、样品稀释液、洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液A、底物显色液B和终止液。
3.根据权利要求2所述的间接ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述酶标抗体为酶标兔抗鹅抗体。
4.一种新型鹅星状病毒抗体的间接ELISA检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)包被:以保藏编号为CCTCC NO:V201808的新型鹅星状病毒ORF1b重组蛋白作为包被抗原,将抗原稀释后加入到酶标板孔中,4℃孵育过夜或37℃孵育2-4h,采用含0.05%吐温的PBST洗涤;
(2)封闭:采用PBST稀释5%脱脂奶粉200μL/孔进行封闭,37℃条件下孵育1h后甩干,用PBST洗涤;
(3)血清作用条件:每孔加入待检血清稀释混合液,37℃条件下孵育1h后甩干,用PBST洗涤;
(4)添加酶标抗体:将酶标兔抗鹅抗体用PBST按1:500稀释,每孔加100μl,37℃条件下作用1h后甩干,用PBST洗涤;
(5)底物显色:TMB底物显色液100μL/孔,37℃条件下避光作用15min;
(6)终止反应:每孔加50μL终止液终止显色反应;采用酶标仪吸光度450nm下读取数据;
(7)阴阳性临界值的确定:根据公式:阴阳性临界值=阴性样本OD450平均值+标准偏差3SD,得到阴阳性临界值;当OD450在0.065以上,判定为阳性;
步骤(1)中,所述新型鹅星状病毒ORF1b重组蛋白由如下方法制备而成:
以保藏编号为CCTCC NO:V201808的新型鹅星状病毒的全基因序列为模板,利用引物对扩增得到ORF1b基因片段,构建重组表达载体;将重组表达载体转化至BL21感受态细胞中,加入IPTG进行诱导表达;将表达产物经过变性和复性后,获得纯化的新型鹅星状病毒ORF1b重组蛋白;
所述引物对的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
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