[发明专利]一种偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种偏甘油酯脂肪酶突变体，是对来源于青霉菌的偏甘油酯脂肪酶进行定点突变而得，其突变位点为下述任意一种或两种以上：(1)该蛋白84位的酪氨酸突变为精氨酸；(2)该蛋白209位的甲硫氨酸突变为丙氨酸；(3)该蛋白260位的异亮氨酸突变为谷氨酸或精氨酸。本发明突变体大幅提高了偏甘油酯脂肪酶的热稳定性和过氧化氢耐受性。另外，相较于野生型偏甘油酯脂肪酶，本发明所得突变体催化酯类进行环氧化反应的能力显著提高，目标产物得率高，在工业应用上具有显著优势。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种热稳定性和过氧化氢耐受性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体的制备方法及其应用。

背景技术

众所周知，环氧化物是一类重要的有机合成中间体，可以通过与含卤素、氮、硫等亲核试剂反应，引入各种类型的基团，合成许多高价值的化合物。制备环氧化物的传统方法常采用化学法，使用一些有毒性且价格昂贵的化学催化剂，如二氧化硅负载钛、甲基三氧化铼等，添加过氧化氢或氧气分子作为氧化剂，生成所需环氧化物。因而，化学法制备环氧化物对环境有一定的毒害作用，并且限制了实际工业生产。生物催化环氧化反应是一类具有广阔发展前景的反应类型，具有反应条件温和、低毒等优势。近年来，脂肪酶催化氧化反应受到了广泛的关注，相较于单加氧酶及卤代过氧化物酶，脂肪酶可以有效催化生成过氧酸，且不需要添加任何辅因子，在制备过程的经济性和环保性上具有重要意义。众所周知，脂肪酶可以催化酯化、水解、酯交换、氨解、醇解、酸解等多种反应且具有较好的耐受高温和有机溶剂的能力。因而，脂肪酶具有极高的工业应用价值，已被广泛应用于医药、食品生产、香料、化工、洗涤等方面。在脂肪酶催化环氧化的过程中，有机酸与过氧化氢生成的过氧酸能直接将不饱和烃类或环酮类环氧化，得到环氧化物或内酯类化合物，且不需要借助任何辅因子。通常情况下，在脂肪酶催化脂类底物发生环氧化反应的过程中，会伴随大量副反应的发生。脂肪酶能催化脂类底物本身及脂类环氧化产物水解，产生脂肪酸，很大程度上降低环氧化产物得率。由于大多数脂类底物为植物油(大多数为甘油三酯)，甘油二酯脂肪酶作为一类只水解甘油二酯及甘油单酯而不水解甘油三酯的底物专一性脂肪酶，在制备环氧化植物油的过程中能有效避免副反应的发生，减少后续脱酸等多项工业分离步骤。

酶工程是一类利用生物技术对酶进行定向改造从而提高其目标特性的方法，通过分析偏甘油酯脂肪酶的三维结构及建立酶-底物的分子对接模型，理性设计突变体，得到具有优良目标特性的酶突变体。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一个热稳定性和过氧化氢耐受性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体，克服现阶段环氧化反应在工业应用中副反应繁杂、产物得率低、在高浓度氧化环境中酶易失活等问题。

本发明的技术方案如下：

本发明通过分析来源于青霉菌的甘油二酯脂肪酶PCL的三维结构(PDB：5CH8)及建立酶-底物的分子对接模型，理性设计突变位点，采用定点突变的方法制备突变体。

一种偏甘油酯脂肪酶突变体，是对来源于青霉菌的偏甘油酯脂肪酶进行定点突变而得(图1)，其突变位点为下述任意一种或两种以上：

(1)该蛋白84位的酪氨酸突变为精氨酸(Y84R)；

(2)该蛋白209位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(M209A)；

(3)该蛋白260位的异亮氨酸突变为谷氨酸或精氨酸(I260E或I260R)。

优选地，所述突变体的DNA序列为SEQ NO.2，SEQ NO.3，SEQ NO.4或SEQ NO.5。

优选地，所述突变体的氨基酸序列为SEQ NO.6，SEQ NO.7，SEQ NO.8或SEQ NO.9。

所述的偏甘油酯脂肪酶突变体在制备环氧化酯类中的应用。

优选地，在制备环氧化酯类时，反应条件为：pH值为5.0±0.5，温度40±10℃。