[发明专利]Ogura CMS不育恢复基因RfoB

权利要求书

1.Ogura CMS不育恢复基因Rfo^B，其特征在于，其核苷酸序列是根据结球甘蓝（Brassica oleracea var. capita）密码子偏好性对萝卜（Raphanus sativus）Ogura CMS细胞质不育Rfo恢复位点的Rfo基因编码区cDNA序列进行密码子优化而成，所述萝卜Ogura CMS细胞质不育Rfo基因编码区cDNA序列如SEQ ID No.1所示；所述Ogura CMS不育恢复基因Rfo^B的ORF（开放性阅读框）具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述恢复基因Rfo^B基因自起始密码子 (ATG) 上游起第103位处插入有来自马铃薯（Solanum tuberosum）ST-LS1基因的一段内含子序列，所述ST-LS1基因的一段内含子序列如SEQ ID No.3所示；所述恢复基因Rfo^B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.权利要求1所述的Ogura CMS不育恢复基因Rfo^B在制备Ogura CMS细胞质雄性不育恢复系中的应用。

3.表达如权利要求1所述的Ogura CMS不育恢复基因Rfo^B的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体含有Rfo^B表达元件，Rfo^B表达元件中的启动子是PRfo，PRfo的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

4.如权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于，所述Rfo^B表达元件中的终止子为E9-t，E9-t的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

5.如权利要求4所述的植物表达载体，其特征在于，所述Rfo^B表达元件的下游插入有筛选标记基因表达元件，所述筛选标记基因是BAR基因（除草剂草丁膦抗性基因）。

6.如权利要求5所述的植物表达载体，其特征在于，所述筛选标记基因表达元件中的启动子为CaMV35S。

7.权利要求3-6任一项所述的植物表达载体在制备Ogura CMS细胞质雄性不育恢复系中的应用。

8.权利要求1所述的Ogura CMS不育恢复基因Rfo^B在制备Ogura CMS细胞质雄性不育恢复系中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）人工合成恢复基因Rfo^B序列，并将Rfo^B序列克隆于PUC57 (GenBank: Y14837.1)质粒上；

（2）提取甘蓝型油菜Ogura CMS 恢复系ougRR-271基因组DNA，采用引物对pRfo-F和pRfo-R，以ougRR-271基因组DNA进行PCR扩增，获得启动子PRfo片段，将获得PRfo的克隆于PBluescripte SK质粒的EcoRV位点进行测序，PRfo的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，pRfo-F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，pRfo-R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；

（3）提取豌豆基因组DNA，采用引物对E9-F和E9-R，以豌豆基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得终止子E9-t，将获得的E9-t克隆于PBluescripte SK质粒的EcoRV位点进行测序，E9-t的核苷酸序列如SEQ ID No.6，E9-F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，E9-R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；

（4）以植物表达载体pCA1300BAR为基础进行改建，改建包括以下步骤：

步骤①，将克隆验证的E9-t终止子序列从PBluescripte SK质粒上用EcoRI+BamHI双酶切下后替换pCA1300BAR中的Nos终止子；

步骤②：将合成的Rfo^B基因用NcoI+BamHI切下插入步骤①获得的载体的NcoI和BamHI位点之间；

步骤③：将克隆到的PRfo启动子用HindIII+NcoI切下替换步骤②获得的载体中的双35S启动子，获得最终的植物表达载体PRfo：：Rfo^B-E9_t；

（5）构建的植物表达载体PRfo：：Rfo^B-E9_t转化农杆菌EHA105，将含PRfo：：Rfo^B-E9_t农杆菌转染化芸薹属Ogura CMS细胞质不育系的外植体，转化后的外植体经筛选培养获得转基因植株，即为芸薹属Ogura CMS细胞质雄性不育恢复系；

所述植物表达载体pCA1300BAR的核苷酸序列为SEQ ID No.11，所述植物表达载体PRfo：：Rfo^B-E9_t中的Rfo^B基因表达盒如SEQ ID No.12所示。