[发明专利]花豇豆酯酶的提取方法及其在有机磷农药残留检测中的应用

说明书

本发明采用粉碎离心的方法从花豇豆中提取花豇豆酯酶，并通过浓度不同的硫酸铵溶液盐析后用乙醇沉淀的纯化工艺对花豇豆酯酶粗液进行纯化，根据酶抑制法原理，利用花豇豆酯酶水解底物α‑乙酸萘酯生成乙酸和α‑萘酚，α‑萘酚与固蓝B盐作用生成紫红色的偶氮化合物。通过制作速测卡来检测农药对酶活性的影响，当花豇豆酯酶受到有机磷农药抑制后，会影响显色反应，因此，根据产生的显色反应强弱指示农药残留情况。

技术领域

本发明涉及农药技术领域，尤其涉及一种花豇豆酶的提取方法及其在有机磷农药残留检测中的应用。

背景技术

农药在农业生产中必不可少，我国是农业大国，也是农药生产和使用大国，不可否认的是，农药在防治虫害、去除杂草等方面都起到了重要作用，但农药是以一类有毒且会残留在土壤、蔬菜中的化学物质，过度地使用会给人类的健康带来不可估量的危害，并且残余在土壤中的农药会破坏生态环境，影响耕种环境。相关报道讲明，我国大量的农药没有得到利用，主要经农药残留扩散到大气环境，并通过降水污染系统，污染土壤，最后通过植物根部吸收进入富集，且通过食物链进入人体，致使人体农药中毒等事件的发生。

此外，自有机氯农药被禁用以来，有机磷农药成功成为我国使用量最大的农药，广泛使用中的有机磷农药品种属于高毒性农药，大量使用会造成许多潜在的危害，如污染环境、药害以及人畜中毒等。

目前，我国在农业生产上主要有四大类农药，分别是有机氯类、有机磷类、氨基甲酯类、拟菊除虫酯类农药，其中，有机磷农药属有机磷酸酯类化合物属于有机磷酸酯或硫化酸酯类化合物，多呈黄色或棕色油状脂溶性液体，少数为结晶固体，易挥发，遇碱易分解。目前使用的种类较多，包括甲拌磷(3911)、内吸磷(1059)、对硫磷(1605)、特普、敌百虫、乐果、马拉松(4049)、甲基对硫磷(甲基1605)、二甲硫吸磷、敌敌畏、甲基内吸磷(甲基1059)、氧化乐果、久效磷等。有机磷杀虫经皮肤、粘膜、消化道、呼吸道吸收后，很快分布全身各脏器，以肝中浓度最高，肌肉和脑中最少。有机磷农药使用机制为抑制神经质酶的活性，使神经质酶不能水解，从而引起相应的中毒症状。

对于农药残留的检测，国内外均有相关的研究，相关研究可知，目前农药残余的检测主要依赖于气相色谱法、高效液相色谱法、气/液相色谱-质谱联用法以及毛细管电泳法、免疫法、生物传感器等，以上检测方法检测灵敏度与准确度均较高，但需用到气相色谱仪等精密仪器，仪器的高要求使得农药残留检测无法走进实验室，走进蔬果种植大棚、走进人们的日常生活。此外，以上检测方法所需样品也需要极其复杂的前处理，也给农药检测带来极大的不便，给检测人员增加检测难度。

其次，在各大农药检测中，还有一种检测方法，即已被重点研究的酶抑制检测法，目前，酶抑制法主要用于有机磷类农药和氨基甲酸酯类农药的检测。酶抑制法可以分为两类，一类是动物胆碱酯酶抑制法，另一类是植物酯酶抑制法。酶抑制法具有检测快速、操作简易、成本低等优点，受到社会各界的关注。此前，我们多以乙酰胆碱酶检测农药为检测方法，但其酶源多为沙丁鱼以及苍蝇头部等昂贵材料，也使得检测成本较高且取材难。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种花豇豆酶的提取方法及其在有机磷农药残留检测中的应用。

为解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：一种花豇豆酶的提取方法，包括以下步骤：

(1)、粉碎：用电子天平称取20克花豇豆，用粉碎机粉碎，过100目筛，置于烧杯；

(2)、混合：向烧杯加入120mL 0.1mol/L，pH 6.5磷酸盐缓冲液,振荡或搅碎10～30min；

(3)、静置、过滤：在4℃冰箱中浸泡过夜、用4层纱布过滤；

(4)、离心：于4℃条件下，10000r/min冷冻离心10min收集上层清液，即为粗酶液；

(5、)纯化：