[发明专利]制取水痘病毒原液的方法及其应用

说明书

一种制取水痘病毒原液的方法，其特征在于先在MRC‑5细胞的细胞培养阶段于无血清培养基加入5v/v％牛血清，然后接种VZV‑OKa毒株，改用无血清培养基作为维持液培养病毒获得水痘病毒原液。本发明的制取水痘病毒原液的方法，采用合适的减血清培养基培养细胞，无血清条件培养VZV病毒，将其应用于水痘减毒活疫苗的制取，可以大幅降低疫苗中的牛血清白蛋白残留量60％以上。

技术领域

本发明涉及一种制取生物制品的方法，尤其涉及一种水痘疫苗的制取方法，降低牛血清白蛋白的残留量。

背景技术

牛血清(FBS)是一种成分复杂的混合物，其中主要成分有蛋白质类、多肽类、激素类、以及氨基酸、葡萄糖、微量元素等其他成分。血清在细胞培养中具有极为重要的功能，如：可提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；起酸碱度缓冲液作用；以及提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。

水痘减毒活疫苗是将水痘病毒OKA株接种至MRC-5细胞，病毒经过扩增复制后收获、提取、纯化和分装冻干制成。MRC-5细胞为人胚肺成纤维细胞，是一种贴壁细胞，其贴壁和生长过程对牛血清具有高度依赖性，因此必须在细胞培养阶段添加牛血清。目前水痘疫苗的生产均采用MEM培养基，在细胞培养阶段添加10％FBS，在病毒培养阶段降低牛血清浓度为2～3％。

牛血清对细胞培养起到促进作用的同时，其使用也给生物制品的生产带来很多问题。虽血清大部分成分已为人所知，但还有一部分仍不清楚，作为动物来源成分，有携带外源因子的风险；血清蛋白增加了后续疫苗纯化工作的困难；血清的组成及含量通常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而存在差异，这种血清自身的批间差异必然导致不同批次细胞生长效果的差别；另外血清使用成本高，每升培养液的成本中血清约占80％。为了使与传染源相关的风险降到最低，国际上存在多个国家之间限制进出口生物材料的国际法规。FDA目前已不受理利用血清进行细胞培养的新药申报，并与美国农业部严密控制胎牛血清在细胞培养中的使用；一些会议在全球范围内号召减少FBS的使用。我国药品管理法对生物制品的质量和安全性也提出严格要求，鼓励生产过程尽量降低血清的使用量或寻找替代血清及动物组分的原材料。

水痘疫苗是一种减毒活疫苗，无法像灭活疫苗或亚单位疫苗一样进行精制纯化，只能通过洗涤和离心尽可能去除杂质成分。在细胞和病毒培养阶段所添加的牛血清成分一般通过多次洗涤降低残留量。但洗涤作为一个关键工序，若洗涤不充分，将直接导致该批次牛血清残留超标而直接废弃。若洗涤过度，又使得病变细胞被冲掉，导致某批次原液回收率低，滴度下降，进而影响产量。

无血清培养基(Serum Free Medium，SFM)是继天然培养基、有血清合成培养基之后研制的一类限定成分培养基，一般无需添加血清既可满足细胞生长繁殖，除特殊情况或某些应用中可能要添加生长因子或细胞因子，如粘附因子、生长因子、必需的营养物质和激素等。无血清培养或减血清培养可以减少上述血清带来的不利因素，降低外源物质污染风险，减少细胞培养批间差，使细胞培养条件更为稳定。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种制取水痘病毒原液的方法，以实现降低水痘减毒活疫苗中牛血清白蛋白残留量。

本发明的另一个目的在于提供一种制取水痘疫苗的方法，采用减血清培养基和无血清培养基制取水痘病毒原液。

本发明提供的一种制取水痘病毒原液的方法，先在MRC-5细胞的细胞培养阶段于无血清培养基加入5v/v％牛血清，然后接种VZV-OKa毒株，改用无血清培养基作为维持液培养病毒获得水痘病毒原液。