[发明专利]一种抗AMH单克隆抗体的制备及其应用

说明书

本发明涉及抗人AMH抗体及其应用。本发明制备了多种抗体,并进行配对筛选,获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及两种分泌可配对的抗AMH单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

抗穆勒氏管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）是转化生长因子β 超家族的成员之一，由Professor Alfred Jost于1974年首先发现。AMH是由两个相同的70KD亚基，通过二硫键连接组成的二聚糖蛋白，相对分子质量为140KD；人类AMH编码基因位于19号染色体短臂，大小2.4～2.8kb，含有5个外显子。

抗穆勒氏管激素（AMH）在性腺器官发育过程中起着重要作用，是男女性腺功能的重要标记物之一。在男性AMH主要由睾丸间质细胞产生，始于胚胎形成并贯穿生命始终；在男性胎儿的发育过程中，AMH导致穆勒氏管退化，形成正常发育的男性生殖管道。在女性AMH主要由卵巢颗粒细胞产生，血清AMH保持相对于男性较低的一个水平，从青春期开始，血清AMH水平随时间慢慢降低，并在更年期降低到ELISA法检测不到的水平。

AMH的正常值界于2-6.8ng/ml之间，AMH数值越高，代表卵子存量越丰沛，适合受孕的黄金期较长，AMH值越低则卵巢功能越差，35岁过后AMH值会开始急剧下降，当AMH值低于0.7ng/ml时，表示卵子库存量已严重不足，几乎难以受孕。若AMH值大于6.8时，可考虑有多囊性卵巢症候群的体质，使用排卵针剂、药物时，卵巢也容易对反应过度而排出过多的卵子，造成卵巢过度刺激症候群。

发明内容

本发明的目的是提供单克隆抗体AMH-1和AMH-2。其中单克隆抗体AMH-1的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:XX所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:XX所示；单抗AMH-2重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:XX和SEQ ID NO:XX所示。

本发明还提供上述抗AMH单抗的应用。利用抗体AMH-1作为包被抗体，AMH-2作为标记抗体，建立了DAS-ELISA方法，以检测天然血清中的AMH。

附图说明

图1是单克隆抗体的配对筛选结果；

图2是抗体AMH-1、AMH-2的分型鉴定结果。

图3是使用抗体分型鉴定试剂盒SBA Clonotyping System-HRP（SouthernBiotech， cat: 5300-05），ELISA检测OD450计数结果。

图4使用抗体分型鉴定试剂盒SBA Clonotyping System-HRP（Southern Biotech，cat: 5300-05），按说明书方法进行鉴定结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞的获得及其单克隆抗体的制备

1. 动物免疫

免疫原为大肠杆菌重组表达蛋白（59KD），编码序列为NP_000470（Arg26 – Arg560），购自北京爱必信生物科技有限公司，货号为TP710250。用此重组蛋白免疫6周龄体重18-20 g的 BALB/c雌性小鼠。即AMH重组蛋白100 µg/只与福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.3 mL/只，后每间隔2周，取80 µg/只抗原和福氏不完全佐剂充分乳化后，腹腔注射0.3 mL/只，免疫第4次的一周后，对小鼠进行眼球取血，检测血清效价，取效价达到1:10⁵及以上的小鼠进行脾脏加强免疫，脾脏免疫时，重组抗原量为30ug/只，3天后取脾细胞进行细胞融合。

2. 饲养层细胞的制备