[发明专利]一种结构化照明的光切片荧光显微成像方法和装置

说明书

本发明公开了一种结构化照明的光切片荧光显微成像方法和系统，属于光学成像技术领域，包括光源、承载荧光样品的样品台和检测荧光样品发出荧光的检测系统；光源和样品台间设有沿光路依次布置的：将光束变为径向偏振光的偏振片和径向偏振转换器；对径向偏振光进行相位调制的相位掩模板；对调制后的光束进行衍射的衍射光栅；以及移动荧光样品上照明图案的振镜；由振镜出射的光束从Y向照射到荧光样品上，检测系统从Z向收集荧光；还包括一处理器，控制振镜从X向移动照明的照明图案和控制样品台在Z向移动，并对检测系统收集的光强分布图像进行处理和重构，生成样品的三维图像。通过该装置和方法形成的光束，在具有较小的主瓣的同时具有较大的视场。

技术领域

本发明涉及光学成像技术领域，具体地说，涉及一种结构化照明的光切片荧光显微成像方法和装置。

背景技术

近年来生物技术的高速发展，需要我们对生理过程具有更加深刻的理解，这也对3D实时成像技术提出了更高的要求。但是，3D实时成像技术的发展，也面临着许多挑战——成功的3D实时成像技术，需要同时达到高空间分辨率、高成像速度、良好的光切片能力、低光损伤和光漂白能力。而这些特性往往是相互矛盾的，比如，如果想要获得具有较高的空间分辨率的图像，就可能需要花费更多的时间，这就牺牲了成像速度；而且需要加入更高的泵浦能量，这会提高对样品的光损伤和光漂白能力。

目前已经有了许多3D实时成像的技术，比如宽场显微技术、共聚焦显微技术、双光子荧光显微技术、以及光切片荧光显微技术。其中，光切片荧光显微技术，由于其高速、低光漂白性和成像的无创性等优势，在这几年里得到了极其迅速的发展。

例如公布号为CN103743714A的中国专利文献公开了一种倾斜宽场光切片扫描成像显微系统及其成像方法，由激光发射装置发射的激光入射二维扫描振镜、准直透镜组及第一显微物镜组成的激光扫描光路对样品台上的样品进行倾斜扫描；第二显微物镜、场镜、探测器组成了成像探测光路，其光轴与激光扫描光路光轴垂直，成像显示控制装置通过数据采集卡、样品台控制装置分别控制二维扫描振镜、第二显微物镜、探测器的同步动作及样品台的自动位移，对采集的探测器成像数据处理形成样品宽场三维图像信息。该发明可实现宽场扫描成像，但分辨率不高。

为了提高光切片荧光显微技术的分辨率，研究者们做出了许多尝试，将受激发射耗损显微技术、结构光照明技术、单分子定位技术等超分辨技术与光切片荧光显微技术相互结合，试图提高光切片荧光显微技术的分辨能力，但效果都不尽如人意。

发明内容

本发明的目的为提供一种结构化照明的光切片荧光显微成像方法，利用该方法可得到分辨率得到提高，视场得到扩大的图像。

本发明的另一目的为提供一种实现上述方法的光切片荧光显微成像装置，该装置采用相位掩模板对径向偏振光进行相位调制，产生一个中心光斑比正常高斯光束窄的光斑。然后，该光斑通过衍射光栅形成一系列重复图案，再通过振镜移动，在每一个平面拍摄数张图片，通过常规宽场结构照明显微的对原始图像的处理方法，对这些图像进行处理，最后得到分辨率得到提高，视场得到扩大的图像。

为了实现上述目的，本发明提供的结构化照明的光切片荧光显微成像方法包括以下步骤：

1)激光经过扩束准直后，转换为径向偏振光，径向偏振光经过相位调制和衍射形成一组沿X向排列的照明图案，并沿Y向投射到荧光样品上激发荧光；

2)从Z向收集荧光，得到Z向位置的光强分布图像；

3)沿X向移动照明图案，在移动过程中，从Z向收集荧光得到多幅光强分布图像，处理后得到Z向的二维图像；

4)以固定的步长沿Z向移动荧光样品，重复步骤3)得到样品在每个Z向位置处的一组光强分布图像，对多组光强分布图像进行处理得到多个Z向位置处的二维图像；

5)对多个Z向位置处的二维图像进行三维重构，实现对样品的三维成像。