[发明专利]一种金银忍冬茎尖超低温保存方法

说明书

本发明涉及一种金银忍冬茎尖超低温保存方法，依次包括：金银忍冬茎尖的剥离和预处理、装载、脱水、液氮保存、解冻以及恢复培养的方法。本发明可保持其优良特性、操作方便、可行性强，利于保存优良种质资源。用茎尖经超低温保存后其遗传物质相对稳定，大部分可直接形成完整的小植株，故在金银忍冬种质资源保存以及其他相关研究方面上具有重要的使用价值。

技术领域

本发明涉及一种茎尖长期保存方法，具体是一种金银忍冬茎尖超低温保存方法。

背景技术

金银忍冬，别名金银木，属忍冬科忍冬属，是我国良好的观赏灌木之一。树皮常具有不规则纵列，颜色呈灰白色至灰褐色。金银忍冬花腋生，每2朵小花生于一枚总花柄上，单花为唇形花冠，花朵开放时期为白色，开放后逐渐变为淡黄色，层层开花，金银相映。果实为红色浆果，常簇生于长枝上，秋天观赏，红果累累。金银忍冬花朵清雅芳香，是优良的蜜源树种；金银忍冬适应环境能力强，喜光、耐半荫，耐寒且耐旱，管理简单；金银忍冬的果、叶和花中含有丰富的脂肪、类胡萝卜素和维生素C；金银忍冬果实多糖含量高且果的多糖是一种天然抗氧化剂，在医疗、食品及化妆品产业均有开发利用价值；金银忍冬全株都有药用价值,可以增强免疫力，具有清热解毒的功效，其中叶的浸汁可杀棉蚜虫等,花则可作金银花用。因此，金银忍冬在观赏、工商业及药用方面具有较高的应用价值。由于金银忍冬茎尖的超低温保存可以维持金银忍冬的遗传稳定性，为了避免由于外界气候的变化以及人类的过度开发而导致的金银忍冬种质资源的灭绝，所以可用茎尖进行超低温保存，从而保持其优良特性。

超低温保存是指通过一定的保存处理，使保存材料可以实现在－196℃液氮低温中安全长期保存，取出时并采取一定的解冻方法令其恢复常温并使材料可以正常恢复生长的一整套生物技术。在这一变化过程中，保存材料细胞内的化学成分没有发生实质性的变化，仅在物理结构方面发生变化，且这种变化是可逆的，因此不会有效损伤到细胞的生物学活性，所以在植物材料解冻后仍然能够保持普通细胞的正常活性及遗传稳定性，从而有效、安全地长期保存植物种质资源。由于茎尖的分生组织细胞的分化程度较小，在超低温保存后的再生过程中遗传物质相对于其他材料稳定，大部分可直接形成完整的小植株，可大大降低植物变异的可能性，特别是针对一些通过营养繁殖的植物种类和一些易产生变异的植物类型，茎尖更是最理想的超低温保存材料。

用茎尖进行超低温保存，其优点是：遗传稳定性强、可保持其优良特性、操作方便、可行性强，利于种质资源的保存。

目前，金银忍冬茎尖超低温保存还尚未见报道。所以研发一种适合于金银忍冬茎尖超低温保存的方法是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

本发明涉及一种金银忍冬茎尖超低温保存的方法，依次包括：金银忍冬茎尖的剥离和预培养、装载、脱水、液氮保存、解冻以及恢复培养的方法。

优选地，所述的剥离和预培养是指：将剥离后的茎尖放入预培养液中处理，预培养液中蔗糖最适浓度为0.3mol/L的MS溶液，于4℃条件下预培养3d。

优选地，所述的装载具体是指：将预培养后的离体茎尖转接于LS装载液中，于室温25℃下装载10～50min；所述的装载液的组成为：2M甘油+0.4mol/L蔗糖+MS的溶液。

优选地，所述的脱水具体是指：将装载后的茎尖放入PVS2保护液于0℃条件下脱水20～100min；所述的PVS2保护液的组成为：30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖+MS的溶液。

优选地，所述的液氮保存是指：将PVS2保护液处理后的茎尖更换新鲜的PVS2保护液，然后迅速投入液氮中，保存24h。

优选地，所述的解冻是指：将液氮保存后的冷冻管取出进行化冻，所述的化冻方式为：用40℃水浴解冻茎尖70s。