[发明专利]杂合抗菌肽FW-CP及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种新型杂合抗菌肽FW‑CP及其制备方法和应用。本发明通过对鸡源抗菌肽Fowlicidin‑2与猪源抗菌肽cecropin P1的氨基酸序列进行空间结构分析的基础上，将抗菌肽Fowlicidin‑2与抗菌肽cecropin P1进行拼接，中间加入蛋白Lingker，同时进行部分位点氨基酸突变，获得一种新型杂合抗菌肽FW‑CP，使其抗菌效力获得显著提高。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型杂合抗菌肽FW‑CP基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后可制成粉剂、液体等抗菌肽制剂用于畜禽疾病的预防和治疗。

技术领域

本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种杂合抗菌肽FW-CP及其制备方法和应用。

背景技术

抗菌肽是生物体内存在的一种具有抗菌活性的小分子蛋白，广泛分布于哺乳动物、甲壳动物、鱼类、昆虫、两栖动物、鸟类、植物、细菌和病毒等生物体内，与干扰素、补体等组成了宿主的免疫防御系统，是宿主先天性免疫的重要组成部分。鸡源抗菌肽Fowlicidin-2由37个氨基酸组成，是Alessandro TOSSI等于1995年首先从猪骨髓细胞分离得到的。其N端与天蚕素A和B具有相似的结构，对多种革兰氏阴性菌、阳性菌均具有抑制作用，其抗菌活性不受生理盐浓度的影响，甚至在高盐浓度下，仍然保持着良好的抗菌活性，并且具有LPS中和活性，显示了良好的应用前景。猪源抗菌肽cecropin P1是从猪小肠分离出得到的，其含有31个氨基酸残基，分子量是3339Da，不含半胱氨酸，不能形成分子内二硫键，有强碱性的N端和强疏水性的C端，其中酰胺化的C端和螺旋-卷曲-螺旋结构对其广谱抗菌作用极为重要。

天然的抗菌肽在临床应用中存在抗菌能力差、抗菌谱窄和副反应大等缺点，限制了其广泛应用。随着对抗菌肽结构功能与杀菌机理研究的深入，人们开始尝试设计杀菌活力更强、抗菌谱更广的杂合抗菌肽。杂合抗菌肽设计通常采用的方法是将不同来源抗菌肽保守序列拼接，以期提高其抗菌活性。目前，国内外已设计合成了许多种杂合肽，抑菌效果明显优于天然肽，且大大降低了毒性和溶血性。本项目组拟以鸡源抗菌肽Fowlicidin-2和猪源抗菌肽cecropin P1为母本，设计获得一种高抑菌能力和抗菌谱的新型杂合抗菌肽FW-CP，用于畜禽疾病的预防和治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种杂合抗菌肽FW-CP，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种杂合抗菌肽FW-CP，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

本发明的杂合抗菌肽FW-CP可用做畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗制剂。

本发明还提供一种杂合抗菌肽FW-CP的重组毕赤酵母的制备方法，其制备步骤如下：

1)根据杂合抗菌肽FW-CP的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；

2)将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达杂合抗菌肽FW-CP的重组基因工程酵母菌；用该重组基因工程菌高密度发酵表达出杂合抗菌肽FW-CP；

3)对重组表达的杂合抗菌肽FW-CP进一步浓缩、纯化后，测定效价。稀释分装，即为抗菌肽制剂。

本发明是建立在对鸡源抗菌肽Fowlicidin-2与猪源抗菌肽cecropin P1的氨基酸序列进行空间结构分析的基础上，将抗菌肽Fowlicidin-2的N端18个氨基酸与抗菌肽cecropin P1的N端18个氨基酸进行拼接，中间加入蛋白Lingker(PG)，同时进行杂合抗菌肽的4处氨基酸突变(K2V、L13K、G18R和R34A)，并在C末端添加1个N，从而获得一种新型杂合抗菌肽FW-CP，使其抗菌效力获得显著提高。

具体实施方式