[发明专利]一种盖髓材料体外评估模型的制备方法

说明书

本专利申请涉及牙科制剂技术领域，具体涉及盖髓材料体外评估技术领域。本发明公开了一种盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于包括以下步骤：S1.获取离体牙；S2.分离牙髓细胞；S3.扩增细胞；S4.加ECM成球生长；S5.连续诱导，制备人牙本质提取物，将含牙本质提取物的培养基加入到培养板中连续诱导细胞，制成人牙髓类器官模型。本发明选取人体离体牙牙髓细胞，经过细胞分离、扩增，并采用创形式的细胞成球生长方法，最后采用连续诱导的方式，细胞的生长效率高，并高度模拟了人体牙髓器官，提升了整个材料体外评估的效率和准确性。

技术领域

本发明属于牙科制剂技术领域，具体涉及盖髓材料体外评估技术领域。

背景技术

目前，在我国每年有大量的患者因为龋坏或外伤导致牙髓暴露或接近暴露，该疾病可能继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症，龋齿的继发感染可以形成病灶，致成或加得关节炎、心骨膜炎和多种眼病等全身其他疾病。目前针对上述情况，在没有明显不可逆感染的情况下，患牙需要接受盖髓治疗，即用盖髓材料直接至于暴露的牙髓组织处，起到封闭暴露牙髓，避免感染和进一步刺激以及促进局部牙本质桥形成的作用。盖髓治疗又叫盖髓术，是一种保护活髓的方法，即用具有使牙髓病变恢复效应的制剂覆盖在近髓的牙本质上或已穿露的牙髓创面上，以保护牙髓，使其病变消除，盖髓术分为直接盖髓术和间接盖髓术。间接盖髓术适用于深龋引起的可复性牙髓炎，自发性痛，除腐质后未见穿髓而难以判断的慢性牙髓炎(可作为诊断性治疗)。直接盖髓术，用于意外穿髓、穿髓孔直径不超过0.5mm者，年轻恒牙的急性牙髓炎，或无明显自发痛的患牙，在除腐质穿髓时，其穿髓孔小，牙髓组织鲜红而敏感者。

因为盖髓材料和牙髓组织直接接触，对其材料生物相容性要求极高，一种理想的牙科盖髓材料要求具备极佳的生物相容性，即(1)能促进牙髓细胞增殖；(2)对牙髓细胞完全无刺激，不会导致牙髓细胞坏死和凋亡；(3)促进局部牙髓细胞矿化，形成牙本质桥。目前常用的直接盖髓材料有氢氧化钙，MTA等材料，虽然这些材料有比较好的性能，但是仍需改进。国内外的牙科产品公司也在不断开发新的牙科盖髓材料，新的材料在临床试验前需要检测材料对牙髓组织的生物相容性。

常用的临床前评估模型有2D细胞检测模型和动物体内模型，但都存在不同程度的问题。目前的体外细胞模型即是在培养平皿上接种人牙髓细胞，细胞呈单层生长，而细胞在体内是呈三维生长状态，用这种模型进行药物筛查检测不能反映人体内实际情况。动物体内模型有多种选择，如啮齿类动物、犬科动物、灵长类动物等，采用啮齿类动物或犬科动物，其牙髓细胞和人牙髓组织细胞差异很大，如小鼠的前牙可以一生都生长，故采用这种方法只能在一定程度上反映药物对牙髓组织的毒性或生物相容性，但是和人牙髓组织存在区别；而采用灵长类动物，则耗费巨大，并且存在违背伦理学审查要求的可能。故目前急需一种基于人牙髓细胞的研究模型来补充现有的牙髓研究模型，即采用人牙髓组织细胞建立的可用于盖髓材料生物相容性筛查的牙髓类器官模型。

发明内容

本发明公开了一种盖髓材料体外评估模型的制备方法，以代替现有的2D细胞检测模型和动物体内模型，实现通过人牙髓组织细胞建立可用于盖髓材料生物相容性筛查的牙髓类器官模型。

为解决上述问题，本发明提供的基础方案为，一种盖髓材料体外评估模型的制备方法，包括以下步骤：

S1.获取离体牙：取口腔门诊上新鲜拔除的健康完整、无牙体牙周疾病的阻生磨牙或因正畸拔除的前磨牙，即刻放入预冷的含青链霉素的无血清DMEM/F12培养基中进行原代培养，随后进行分离培养；

S2.分离牙髓细胞：清洗并将牙齿截断，暴露牙髓，取出牙髓用含青链霉素的PBS冲洗，将牙髓组织剪碎,随后进行离心操作,去除上清，并吸去多余的PBS冲洗液；

S3.扩增细胞：将步骤S2中的牙髓组织加入I型胶原酶溶液，加入含有FBS的DMEM/F12培养基终止消化，随后离心操作，去除上清；将组织块转移培养箱中培养，用胰酶消化收集细胞；将细胞用冻存液重悬后转移至冻存管，放入程序化冻存盒，冷却，后转移至液氮罐长期保存；