[发明专利]一种盖髓材料体外评估模型的制备方法

权利要求书

1.一种盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

S1.获取离体牙：取口腔门诊上新鲜拔除的健康完整、无牙体牙周疾病的阻生磨牙或因正畸拔除的前磨牙，即刻放入预冷的含青链霉素的无血清DMEM/F12培养基中进行原代培养，随后进行分离培养；

S2.分离牙髓细胞：清洗并将牙齿截断，暴露牙髓，取出牙髓用含青链霉素的PBS冲洗，将牙髓组织剪碎,随后进行离心操作,去除上清，并吸去多余的PBS冲洗液；

S3.扩增细胞：将步骤S2中的牙髓组织加入I型胶原酶溶液，加入含有FBS的DMEM/F12培养基终止消化，随后离心操作，去除上清；将组织块转移培养箱中培养，用胰酶消化收集细胞；将细胞用冻存液重悬后转移至冻存管，放入程序化冻存盒，冷却，后转移至液氮罐长期保存；

S4.加ECM成球生长：制备人牙髓特异性ECM，将步骤S3所获取牙髓细胞接种于培养板中，加入含有人牙髓特异性ECM的培养基进行培养；步骤S4中人牙髓特异性ECM制备的具体方式为，收集新鲜拔除的正畸牙或者阻生牙，取出牙髓组织，采用胰酶消化液处理，洗去残留胰酶，冻存2天，换用Triton X-100处理4天，冲洗后采用真空冻干机冻干2天，将冻干的组织块粉碎成粉末，采用γ射线消毒；将上述消毒后的组织粉末和胃蛋白酶混合，加入HCL溶液溶解，离心操作，将所得上清液过滤后低温保存备用；

S5.连续诱导：制备人牙本质提取物，将含牙本质提取物的培养基加入到培养板中连续诱导细胞，制成人牙髓类器官模型；将拟检测盖髓材料的浸渍液加入到S5建立的人牙髓类器官模型，用盖髓材料处理后制成人牙髓细胞3D盖髓模拟模型；

所述步骤S5中的制备人牙本质提取物的具体方式为，收集新鲜拔除的正畸牙或者阻生牙，截断丢弃牙冠，保留牙根，去除牙根表面的软组织和磨出外壁残留牙骨质，去除根管内残留的牙髓，清洗，将牙本质磨成小块，浸入去离子水中用超声清洗机荡洗，然后用EDTA溶液处理，处理后将其储存在含青链霉素的PBS中3天，接着用超声清洗剂荡洗，然后将其研磨成粉末，将上述粉末加入到α-MEM培养基中，充分搅拌，取所制备的人牙本质提取物的100％萃取液。

2.根据权利要求1所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中获取离体牙的患者年龄控制在11-22岁之间。

3.根据权利要求1所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：所述S2中牙齿的截断位置为牙釉质牙骨质界。

4.根据权利要求1所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中I型胶原酶溶液的浓度为3mg/mL，I型胶原酶溶液体积是组织块体积10倍以上。

5.根据权利要求1所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中在进行细胞收集之前，细胞长至汇合度达70％。

6.根据权利要求1所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：所述EDTA溶液处理是采用浓度为17％的EDTA溶液处理5min，浓度为10％的EDTA溶液处理5min，浓度为5％的EDTA溶液处理10min。

7.根据权利要求6所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：在所述S5之后进行步骤S6，将拟检测盖髓材料的浸渍液20μL加入到S5建立的人牙髓类器官模型，用盖髓材料处理后制成人牙髓细胞3D盖髓模拟模型。

8.根据权利要求7所述的盖髓材料体外评估模型的制备方法，其特征在于：评估内容包括live/dead法检测活和死细胞比例、HE染色研究牙髓类器官模型形态结构变化、TUNEL法检测凋亡细胞数量、茜素红S染色检测材料诱导矿化能力、免疫荧光法检测特定炎症蛋白的表达。