[发明专利]一种肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体及其构建方法有效
| 申请号： | 201810362418.5 | 申请日： | 2018-04-20 |
| 公开（公告）号： | CN108517335B | 公开（公告）日： | 2019-11-26 |
| 发明（设计）人： | 刘建军;任晓虎;阮嘉雯;刘威;黄新凤 | 申请（专利权）人： | 深圳市疾病预防控制中心(深圳市卫生检验中心;深圳市预防医学研究所) |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N15/66 |
| 代理公司： | 44451 深圳市添源知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 黎健任<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 518000 *** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 多克隆位点序列 肝细胞 慢病毒表达载体 酶切位点 重组质粒 低表达 基因工程技术 抗性基因序列 启动子序列 重组慢病毒 表达载体 病毒载体 基本序列 转染效率 构建 人源 正向 | ||
1.一种肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体，其特征在于：包括pLVX-shRNA2-puro病毒载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和tudmiRNA-199b序列；所述多克隆位点序列包括Hind III酶切位点和BamH I酶切位点，所述tudmiRNA-199b序列正向插入所述多克隆位点序列中；所述tudmiRNA-199b序列为：
GGATCCGGTGGCGCTAGGATCATCAACCCCAGTGTTTAGAATCTCTATCTGTTCCAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACCCCAGTGTTTAGAATCTCTATCTGTTCCAAGATGATCCTAGCGCCACCTTTTTTGAATTC，即SEQ IDNO：1。
2.根据权利要求1所述的肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：tudmiRNA-199b序列的设计：通过miRBase库找到与SET基因关联的miRNA-199b基因的反向互补序列，并引进Hind III和Bgl II特异性酶切位点，设计tudmiRNA-199b序列为：GGATCCGGTGGCGCTAGGATCATCAACCCCAGTGTTTAGAATCTCTATCTGTTCCAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACCCCAGTGTTTAGAATCTCTATCTGTTCCAAGATGATCCTAGCGCCACCTTTTTTGAATTC，即SEQ ID NO：1；
S2：合成得到tudmiRNA-199b序列；
S3：tudmiRNA-199b重组质粒的获得：pLVX-shRNA2表达载体和步骤S2得到的tudmiRNA-199b序列分别经Hind III和Bgl II限制性内切酶双酶切后，T4 DNA连接酶连接得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明tudmiRNA-199b序列插入成功的菌液进行测序鉴定，将测序鉴定正确的大肠杆菌培养并抽提，得到含tudmiRNA-199b序列的tudmiRNA-199b重组质粒；
S4：肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体的构建：将pLVX-shRNA2-puro病毒载体、步骤S3获得的含tudmiRNA-199b序列的tudmiRNA-199b重组质粒分别用Hind III和BamH I限制性内切酶进行双酶切后，T4 DNA连接酶连接，得到肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体。
3.根据权利要求2所述的肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：所述肝细胞为HL-7702细胞，所述感受态大肠杆菌为JM 109。
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