[发明专利]一种利用纤维素固定化CBD-EndoS融合酶的方法

说明书

本发明公开了一种利用纤维素固定化CBD‑EndoS融合酶的方法，属于固定化酶技术领域。本发明利用CBD‑EndoS的CBD标签将融合蛋白特异性固定于纤维素微球上，不同于传统固定化酶“先纯化后固定”，实现了一步固定纯化，将粗酶中的CBD‑EndoS蛋白固定在纤维素载体上，操作简单，方便快速，大大简化了固定化步骤。应用本发明的方法制备的固定化酶反复使用5次后，酶活仍保持在初始酶活88％以上；固定化酶于4℃条件下保存30天后，酶活仍保持在初始酶活90％以上。本发明有望实现工业化，有助于EndoS酶在抗体修饰研究领域的广泛应用。

技术领域

本发明涉及一种利用纤维素固定化CBD-EndoS融合酶的方法，属于固定化酶技术领域。

背景技术

EndoS是一种来源于化脓链球菌的糖苷内切酶，可以高度特异性地水解抗体Fc结构域上的N糖链。因为抗体连接了先天免疫和适应性免疫，是许多人类免疫反应的中心因素，所以分析和调控EndoS的酶活性会对生物医学的众多领域产生影响。临床上，EndoS增强了化脓性链球菌逃避人类免疫反应的能力，因此Endo-S抑制剂能够用于改善炎症患者的症状。在治疗上，EndoS已经在动物模型中显示出巨大的治疗潜力，可以用于依赖自身抗体的多种自身免疫疾病的治疗；微调EndoS的特异性和活性是将其作为人类蛋白质治疗剂进一步发展的重要研究方向。在生物技术上，EndoS是一种独特的糖蛋白修饰酶，具有除去抗体上糖链的功能，而其突变体具有将糖链连接到抗体上的功能；利用EndoS及其突变体将均一的糖链连接到抗体上，产生均一糖基化抗体库，其对于发挥工程化抗体的全部潜力是至关重要的。

目前EndoS的菌体表达量较低，无法满足未来大规模的抗体修饰研究的需要。酶的固定化是一种将酶限制在一定的载体上，可以连续催化合成产物，并且在反应结束后可以回收和再利用的技术。因此发展EndoS酶的固定化技术及其应用，有助于实现EndoS酶在抗体研究领域的广泛应用。

纤维素是蛋白质固定化的理想载体，因为其具有低成本，惰性，稳定的优点，并且容易以不同形式获得。有研究表明，异源蛋白质融合纤维素结合域(CBD)后形成杂交蛋白质，其具有活性且能够和纤维素结合。因此，通过纤维素结合域将融合蛋白吸附到纤维素上可以作为一种简便的酶固定化技术。另一方面，纤维素载体及其标签还具有一步实现蛋白纯化和固定化的潜力。(参考文献Barbosa O,Ortiz C,Berenguer-Murciaetal.Strategies for the one-step immobilization–purification of enzymes asindustrial biocatalysts[J].Biotechnology advances,2015,33(5):435-456.)

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种具有纤维素结合活性和糖苷内切活性的双功能融合蛋白CBD-EndoS，含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供含有SEQ ID NO.2所示CBD序列的表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体包括pET系列载体，如pET34b(+)、pET35b(+)等。

在本发明的一种实施方式中，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第三个目的是提供表达所述双功能融合蛋白CBD-EndoS的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括真菌细胞或细菌细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞为重组大肠杆菌细胞，所述重组大肠杆菌是用所述的表达载体构建的重组质粒pCBD-EndoS转化至E.Coli BL21的重组细胞。