[发明专利]获得具有溃疡性结肠炎治疗作用的细胞亚群的培养方法

说明书

本发明公开了一种获得具有溃疡性结肠炎治疗作用的细胞亚群(CD90+CD105+)的培养方法，以自体骨髓为处理对象，包括以下步骤：(1)从成人骨髓中分离出单个核细胞，进行培养、扩增；(2)将培养的单个核细胞进行细胞因子活化刺激；(3)根据细胞生长情况，进行扩增传代操作，20天后进行流式检测细胞表型。本发明取骨髓进行单个核细胞分离，采用独特的无血清培养基、自体血清添加物和细胞因子组合下进行干细胞的培养，记录干细胞的增殖能力、检测细胞的亚群含量。本发明能够解决未经培养的干细胞中MSC比例低、增殖能力低的限制、扩增受限等问题。获得具有高比例高效治疗溃疡性结肠炎能力的细胞亚群(CD90+CD105+)。

技术领域

本发明涉及一种干细胞的培养方法，特别涉及利用自体骨髓及相关细胞因子构建CD90+CD105+细胞扩增的优势环境，获得具高纯度、高效治疗溃疡性结肠炎能力的细胞亚群(CD90+CD105+)的培养方法。

背景技术

骨髓的间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，在特定的条件下，能诱导分化形成多种非造血组织细胞(如成骨细胞、软骨细胞、肌细胞等)。骨髓间充质干细胞能够随血液循环到达肠道，并定植于肠组织中，对受损的肠组织起到修复作用。

发明内容

针对上述现有技术，为了弥补溃疡性结肠炎细胞治疗中干细胞含量低的不足，本发明利用自体骨髓及相关因子构建(CD90+CD105+)细胞扩增的优势环境，提供了一种步骤简单、操作稳定的体外扩增培养干细胞、获得具有高效治疗溃疡性结肠炎能力的细胞亚群(CD90+CD105+)的培养方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种获得具有溃疡性结肠炎治疗作用的细胞亚群(CD90+CD105+)的培养方法，以自体骨髓为处理对象，包括以下步骤：

(1)从成人骨髓中分离出单个核细胞，进行培养、扩增；

(2)将培养的单个核细胞进行细胞因子活化刺激；

(3)根据细胞生长情况，进行扩增传代操作，20天后进行流式检测细胞表型。

优选的，所述步骤(1)的主要操作为：

①将采血袋或采血管经酒精浸润的无尘纸擦拭洁净后放入生物安全柜，抽取血袋或采血管中的骨髓分装到50ml离心管中，每管骨髓30ml，经800g下离心10min；

②离心后，将上层清液置于一支新的50ml离心管中。吸至距分界面0.5cm处为止，若剩余骨髓细胞多于15ml，则取上层15ml骨髓细胞置于新的离心管中，弃去底部剩余细胞；

③用生理盐水按照1∶1的比例稀释细胞，取装有15ml ficoll的离心管并倾斜，缓慢的将混匀的骨髓细胞加到ficoll液面上，使其呈清晰的界面，样本与ficoll的比例不超过2∶1，于常温低升降速，500g下离心20min；

④离心后液面将分为4层，从底部分别为红细胞、ficoll层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加生理盐水至45ml，混匀，500g下离心10min；

⑤离心后弃上清，细胞沉淀先用10ml生理盐水重悬，再加生理盐水至40ml，混匀，取样用于细胞数量检测、细胞亚群含量检测，500g下离心10min；

⑥离心后弃上清，用淋巴细胞无血清培养基将细胞密度调整为1-2×10⁶/ml。

优选的，所述步骤(2)的主要操作为：

①用淋巴细胞无血清培养基将细胞密度调整为1-2×10⁶/ml，加入到培养瓶中，37℃、5.0％CO₂浓度培养箱中培养；