[发明专利]包含家蝇抗菌肽基因的重组载体、菌株及其表达和应用

说明书

本发明提供了一种包含家蝇抗菌肽MAF‑1基因的重组载体、包含该重组载体的重组酵母菌株及家蝇抗菌肽MAF‑1基因在重组酵母菌株中的表达方法和表达产物的应用。经证实，本发明能够有效提高所表达出的家蝇抗菌肽MAF‑1的活性和表达产物家蝇抗菌肽MAF‑1的生产效率，在该条件下发酵表达家蝇抗菌肽MAF‑1，可达到50～75mg/ml的发酵水平，大大降低生产成本。同时，本发明还提供了上述重组酵母菌株或其表达的家蝇抗菌肽MAF‑1在家禽饲料添加剂中的应用，通过在家禽饲料添加剂中使用该重组酵母菌的干燥灭活菌体或其所表达出的家蝇抗菌肽MAF‑1为防治家禽念珠菌病开辟了一条新的路径。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种包含家蝇抗菌肽MAF-1基因的重组载体、该重组载体的构建方法及家蝇抗菌肽MAF-1基因在含有该重组载体的酵母中的表达方法和表达产物的应用。

背景技术

家禽念珠菌病由白色念珠菌起引的禽类上消化道的一种霉菌病，特征是在上消化道粘膜发生白色假膜和溃疡，多发生于鸡、鸭。虽然不会直接给带来大面积的死亡，但能给禽类带来严重的免疫抑制，造成免疫应答水平低下，体质消弱，抗病差。从而引起肉禽瘦弱，蛋禽产蛋下降。给养殖户带来巨大的损失。且本病没有特异性的防制办法，一旦发生，单纯的治疗效果往往不佳，现有的家禽用抗真菌药物制霉菌素、达美素等效果均不如人意。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMP)是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子多肽，具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抑制肿瘤细胞及免疫调节活性。其作用机制独特、理化性质稳定，仅作用于病原微生物，对人正常细胞无副作用。AMP这种选择性特点在抗病原微生物药物研发中具有较大的发展潜力。AMP的获取主要是从动物体内分离提取，且资源有限、价格昂贵，限制其规模化生产。

家蝇抗菌肽MAF-1(Musca domestica antifungal peptide-1)是经免疫诱导后从家蝇幼虫血淋巴中分离得到抗菌肽，结构特征独立于目前发现的昆虫抗菌肽种类，GenBank登录号HM178948。家蝇抗菌肽MAF-1分子量为17203.384Da，其成熟肽由156个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。经证明该抗菌肽能够杀灭白色念珠菌敏感株，对耐药菌株也同样有效。由于家蝇抗菌肽MAF-1是来源于动物的结构性蛋白，具有安全性高，抑菌效果好，并且不会引起菌株抗药性和机体其他免疫反应的特点，因此具有作为家禽念珠菌病预防用药的应用前景。

前期发明人经免疫诱导后从家蝇幼虫血淋巴中分离得到家蝇MAF-1序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2，序列全长661bp，其中第47～49碱基为启动子ATG和第581～581碱基为终止子TAA，开放阅读框编码178个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3，是经前述含156个氨基酸残基的成熟肽序列逆转录成cDNA序列再经过3’race和5’race扩增得到全长基因，再通过对全长基因进行生物信息学分析，得到该基因所编码的蛋白质序列全长，即包含信号肽和成熟肽的完全肽，分子量为17.2KDa。发明人通过家蝇MAF-1序列已成功构建MAF-1-PET28a-BL21原核表达质粒，研究其原核表达蛋白MAF-1发现其具有抑制白色念珠球菌活性的作用，其最低抑菌活性为70ug/ml，但由于其原核表达体系在蛋白转录后蛋白修饰功能方面的缺陷，导致所表达出的家蝇抗菌肽MAF-1的活性不高(彭传林，魏川川，吴建伟，等。家蝇抗真菌肽MAF-1原核表达条件优化及活性验证。中国公共卫生，2015，31(11)：1420～1423)。

综上而言，由于昆虫抗菌肽的天然资源有限，而化学合成肽类的成本较高，通过基因工程在原核生物中表达抗菌肽生产率低且原核生物所表达的抗菌肽活性不高，因此，如何提高抗菌肽的生产效率，降低成本，是应用抗菌肽必须解决的问题。

发明内容