[发明专利]大肠杆菌周质空间表达的蛋白的提取方法

说明书

本发明属于生物医药领域，涉及大肠杆菌周质空间表达Fab蛋白的提取方法。所述的提取方法包括：将周质空间表达Fab蛋白的重组大肠杆菌菌体混悬于含有二价阳离盐的酸性缓冲液中，进行低压匀浆处理，之后除掉细胞碎片等杂质即得到含有目的蛋白的周质提取液；由此获得的周质提取液调pH值后进行高温加热处理，去除絮状沉淀后得到大肠杆菌周质空间Fab蛋白粗纯化液。本发明提取方法在尽量保证Fab提取收量的基础上有效地去除了Fab相关杂质，将目的蛋白中Fab纯度提高至90％以上，从而降低后续蛋白质层析纯化的难度以及成本。

技术领域

本发明涉及大肠杆菌周质空间表达蛋白质的提取方法，特别涉及大肠杆菌周质空间表达Fab蛋白的提取方法。

背景技术

大肠杆菌作为原核细菌，其遗传背景研究比较透彻，易于培养且发酵培养周期短，是表达外源蛋白的首选细菌。目前大约有40％蛋白质药物是通过大肠杆菌表达系统生产的。外源蛋白在大肠杆菌中的表达方式分为胞质内表达以及分泌表达两种方式。Fab片段是由轻链和重链通过多对二硫键形成的异源二聚体活性蛋白，其在细菌胞内表达时，由于细菌胞内为还原型环境，Fab蛋白不能够进行正确折叠、形成二硫键，最终会形成无任何生物功能的包涵体。后期需要进行复杂的变性以及复性条件的探索，生产工艺比较复杂，目前这种表达方式主要局限于基础研究。为了克服以上问题，研究者们设计研究出大肠杆菌周质空间分泌表达Fab片段的策略。大肠杆菌周质空间为一个氧化型环境，有利于Fab蛋白二硫键的正确形成，且周质空间中蛋白酶含量比较低，能够避免Fab蛋白被蛋白酶降解，极大地提高了Fab蛋白的稳定性。同时，通过大肠杆菌发酵工艺优化，能够极大地提高Fab蛋白在周质空间的表达量。

在大肠杆菌周质空间发酵表达Fab抗体的过程中，Fab抗体重链Fd段以及轻链中的半胱氨酸在周质空间中氧化形成二硫键，最终保证Fab抗体重链Fd段以及轻链在二硫键作用下形成异二聚体，即Fab抗体。然而研究过程中发现，大肠杆菌周质空间表达Fab抗体的过程中，重链Fd段(VH-CH1)以及轻链(VL-CL)有一定几率进行二硫键错配反应，最终导致形成结构错配的Fab抗体以及Fab蛋白多聚体。除此之外，重链Fd段(VH-CH1)以及轻链(VL-CL)本身也可能进行二硫键配对反应，形成重链二聚体以及轻链二聚体。另外，重链Fd段(VH-CH1)以及轻链(VL-CL)自身内部进行二硫键配对，导致周质空间当中存在一定量的重链、轻链单体等成分。因此周质空间表达Fab蛋白的大肠杆菌周质蛋白提取液中不仅含有结构正确的Fab蛋白，也会存在着结构错配的Fab蛋白、多聚体、重链二聚体、轻链二聚体、重链以及轻链单体等Fab相关杂质。因此上述提取液通过亲和层析所制备得到的目的蛋白洗脱液当中仍旧存在Fab相关杂质，且此类Fab相关杂质，在后期分离纯化过程中较难去除，严重影响Fab抗体产品的最终纯度。Fab相关杂质的比例在周质空间不同种类的Fab蛋白表达过程中也有所不同，目前并没有通用的纯化方法能明显去除Fab相关杂质。

当外源蛋白，尤其是Fab抗体蛋白分泌至大肠杆菌周质空间后，需要采用定向释放的技术对周质蛋白进行提取。在周质蛋白提取过程中，内膜破损会导致胞浆内核酸、脂质以及杂蛋白等物质释放出来，严重干扰后期目的蛋白的分离纯化。因此周质蛋白提取方法的关键是只破坏大肠杆菌外膜，而不破坏内膜，最终使大肠杆菌中内膜和外膜之间的蛋白定向释放至提取液中。

文献[Popplewell A G,Sehdev M,Spitali M,et al.Methods Mol Biol,2005,308(308):17-30]提及了一种提取大肠杆菌周质空间Fab蛋白的方法。将菌体与Tris、EDTA溶液混匀后室温条件进行搅拌，上清即为周质空间Fab蛋白提取液。此方法操作过程简单，便于后期大规模放大，但是提取过程中搅拌时间较长(至少12h)，容易导致菌体破裂，得到的提取液过于粘稠，影响后期分离纯化。且此方法对周质蛋白的提取效率有待进一步研究。